TGXAS-山葡萄培苗生产技术规程编制说明.docx

团体标准山葡萄组培苗生产技术规程（征求意见稿）编制说明一、项目来源根据广西标准化协会关于下达2022年第二批团体标准制修订项目计划的通知（桂标协（2022）13号）文件精神，由广西壮族自治区林业局提出，广西壮族自治区林业科学研究院、广西壮族自治区农业科学研究院葡萄与葡萄酒研究所、南宁市翔林生物科技有限公司共同起草的团体标准山葡萄组培苗生产技术规程（项目编号2022-0210）已获立项，为做好该规范编制项目的研究工作，确保人员落实、时间落实和任务落实，加强项目研究工作的指导和管理，确保各项工作的有效实施，特制定本编制方案。二、项目背景及目的意义山葡萄（VitisamurensisRUPr.）又名野葡萄，属葡萄科（vitaceae）葡萄属（vitis）落叶藤本植物。浆果营养丰富，酸甜可口，可食用，药用，亦可酿酒。山葡萄根、藤有祛风止痛之功效，果实有清热利尿之功效。山葡萄及山葡萄酒中富含多种生物活性物质，可用来预防心脏病、血栓病、痴呆症以及延缓皮肤老化，具有良好的医疗保健和美容作用。山葡萄酒是我国的特种葡萄酒，在世界葡萄酒中独树一帜，具有较高的经济价值和巨大的发展潜力。广西罗城、都安建有较为成熟的山葡萄酒生产基地，是我国为数不多的山葡萄酒产地。都安县被授予“中国野生山葡萄红酒基地”称号。“都安野生山葡萄酒”为都安县地理标志产品，曾获得“国际名酒香港博览会金奖”“中国国际爱迪生发明金奖”“欧洲国际名牌金奖”和“中国葡萄酒金羊奖”等荣誉。2009年4月，“密洛陀”牌野生葡萄酒被广西壮族自治区质量技术监督局、广西名牌战略推进委员会授予“2008年度广西名牌产品”称号。综上所述，种植山葡萄具有广阔的市场前景和显著的经济效益；同时对改善生态环境，促进生态农业，生态旅游的发展具有重要意义。山葡萄仅在世界不多的几个地区生长，除了日本、朝鲜、俄罗斯,就只有我国出产，其中广西罗城、都安为我国数不多的山葡萄酒产地。都安野生山葡萄酒自从1993年获得香港国际名酒博览会金奖以后，产品一直供不应求。早在2002年，关于“都安野生山葡萄酒原料生产现状及发展对策”的研究就提出要大力推广组培苗的种植。2005年广西中天领御酒业有限公司在罗城成立，都安山葡萄酒产量由2002年的1000余吨增长到7000余吨。随着野生山葡萄酒产业发展，酿酒原料（野生山葡萄）短缺问题日益凸显。在营造山葡萄园时，选用生长快，能保持母本优良性状，遗传稳定性强的组培苗十分重要。据不完全统计，目前广西植物组培苗有限公司等几家公司近年来生产山葡萄组培苗总计约500万株左右，单株价约812元，总产值约5000万元左右。目前山葡萄组培苗市场成熟度高，收益好，需求量大。因此，急需制定山葡萄组培生产技术规程，以规范组培苗生产技术的各个环节，确保优质酿酒原料的大量快速供应及种苗来源的纯正性。制定“山葡萄组培苗生产技术规程”团体标准，可解决目前市场对优质山葡萄苗木的迫切需求，极大推动山葡萄向生产标准化、规模集约化方向发展，全面提高山葡萄及其酿造红酒产业的竞争力，为广西山葡萄及葡萄酒产业升级和可持续发展提供技术支撑。目前，与山葡萄育苗、栽培有关的标准有DB23T9802005山葡萄栽培技术规程，DB23/T1889-2017山葡萄育苗技术规程，DB22/T1023-2019山葡萄优质安全生产技术规程。这些标准适用硬枝杆插和硬枝嫁接育苗，目前并未有见有关山葡萄组织培养繁育技术规程，尤其是在广西境内。本技术规程的发布可解决目前市场对优质山葡萄苗木的迫切需求，极大推动山葡萄向生产标准化、规模集约化方向发展,全面提高山葡萄及其酿造红酒产业的竞争力，为广西山葡萄及葡萄酒产业升级和可持续发展提供技术支撑。三、项目编制过程（一）成立标准编制工作组2022年2月，团体标准山葡萄组培苗生产技术规程项目任务下达后，广西壮族自治区林业科学研究院成立了标准编制工作组，制定了起草编写方案与进度安排，明确任务职责，确定工作技术路线，开展标准研制工作。具体标准编制工作组成员如下：张晓宁、吴代东、肖玉菲、朱慧、林东、李洪艳、魏秋兰、韦荣福、张烽、周思泓、覃玉凤、成果、覃子海、钟连香、陈博雯。（二）资料收集和整理2022年3月，主要进行山葡萄组培快繁技术的优化及熟化研究工作，逐步形成了一套较成熟的山葡萄组培苗生产技术体系。前期的理论研究与实验基础为本标准的制定打下了坚实基础。资料收集组收集了相关国家标准、行业标准和外省标准，在收集的资料和标准的基础上进行了汇合、整理、分析、总结，对山葡萄组培苗生产技术进行了完善、补充、进一步优化，确定了团体标准山葡萄组培苗生产技术规程的基本内容和思路。2022年4月，标准编制工作组在对收集的资料进行整理研究之后，标准编制工作组召开了标准编制会议，对标准的整体框架结构进行了研究，并对标准的关键性内容进行了初步探讨。2022年10月，经过编制小组成员反复研讨，形成了标准的编制原则及纲要。以试验数据、调查材料为依据，再次对收集的资料进行分析研究和处理，经反复讨论和修改，不断完善，形成了工作组讨论稿。（三）调研及形成征求意见稿2023年2月，召开编制小组会议，对工作组讨论稿的框架、条款等进行了讨论。在前期工作的基础之上，通过理清逻辑脉络，整合已有的参考资料中有关山葡萄组培苗生产技术的内容指标，并结合实际要求的基础上，按照简化、统一等原则编制完成了团体标准山葡萄组培苗生产技术规程（草案）。2023年5月，向广西区内涉及领域的部门及相关专家征求团体标准山葡萄组培苗生产技术规程（草案）意见。同时，深入山葡萄组培苗生产企业进行实地调研，并实地征求团体标准山葡萄组培苗生产技术规程（草案）意见。2023年6月，标准编制工作组向科研院校、林场等单位专家对团体标准山葡萄组培苗生产技术规程（草案）咨询意见，并组内讨论提出完善修改意见，最终讨论形成团体标准山葡萄组培苗生产技术规程（征求意见稿）和（征求意见稿）编制说明。四、标准制定原则和依据1 .编制原则本标准按照中华人民共和国标准GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定进行编写，内容和要求参考了相关法律法规，引用了现行有效的国家标准、行业标准。引用的具体标准和法律法规如下：GB6000主要造林树种苗木质量分级GB/T15776造林技术规程1.Y/T1000容器育苗技术本标准规定了山葡萄（VitiSamUrenSiSRUPr）外植体采集和处理、诱导培养、增殖培养、生根培养、炼苗移栽、苗期管理、苗木出圃、档案管理等技术和要求。界定了山葡萄组培苗生产技术的术语和定义。本标准制定以山葡萄组培苗规范化繁育技术研究的数据为基础，以推进广西山葡萄组培苗培育标准化，实现山葡萄无性系育苗规模化生产，遵循科学性、先进性、合理性和适用性的原则，力求做到科学规范、指标准确、可操作性强，既与国家相关标准接轨，又符合广西实际情况，具有较强的实用性，对山葡萄组培苗生产有积极的推动作用。本标准编写过程中注意与山葡萄组培技术相关法律法规的协调问题，在内容上与现行法律法规、标准协调一致。2 .编制依据本标准各项技术指标确定的依据，主要是经过多年对山葡萄组培苗培育技术的优化、熟化，系统的分析总结，同时也参照了其他树种的相关标准。3 .关键技术指标依据3.1 试验方法(1)外植体采集每年的春夏季节，在连续3d没有雨水的晴朗的中午，选择生长茂盛、健康无病虫害的山葡萄优良单株，采集当年萌发的半木质化的茎段。(2)消毒处理方式的筛选：将采集的山葡萄茎段用湿毛巾包裹带回实验室，剪去叶片，置于洗洁精溶液中浸泡30min,用流动自来水冲洗60min,剪掉枝条切口部分，剪成带腋芽1个2个、长2.0cm3.0cm的茎段，用0.1%多菌灵浸泡5min。用无菌水冲洗3次4次。如表1所示，在超净工作台上，用75%乙醇溶液浸泡外植体(处理时间10s,20s、30s),无菌水迅速漂洗5次6次，再用0.1%升汞溶液浸泡外植体(处理时间IOmin、15min、20min>25min)无菌水漂洗5次6次，将消毒好的外植体两端组织剪去约0.2cm,再用无菌滤纸将枝条表面的水分吸干备用。将茎段接种到初代诱导培养基中。每个处理45瓶，每瓶接种外植体1个，设3个重复，14d后进行观测。表1山葡萄茎段消毒试验设计序号75%酒精消毒时间/s0.1%升汞消毒时间min110102101531020410255201062015720208202593010103015113020123025（3）诱导培养取吸干水分的外植体，在无菌条件下，将切口部分剪掉后，插入初代诱导培养基，每个处理共45个茎段，设3个重复，每瓶培养基接种1个茎段。在山葡萄组织培养过程中，培养室温度设置在25±2,光照时间10hd12hd,光照强度设置为1500Lx2000Lx范围，空气湿度40%50%,培养10d15d,获取初始芽。初代培养基的筛选：以不同基本培养基（MS、改良MS和B5）和不同植物生长调节剂浓度（6-BA：Lomg/L、1.5mg/L、2.0mg/L；NAA：0.2mgL.0.3mgL>0.4mg/L为因素设计3因素3水平Ly(34)的正交试验(表2)。表2山葡萄初代诱导培养影响因素正交设计表序号基本培养基植物生长调节剂mgL6-BANAA1MS1.00.22MS1.50.33MS2.00.44改良MS1.00.35改良MS1.50.46改良MS2.00.27B51.00.48B51.50.29B52.00.3(4)增殖培养带带待初始芽长至4cm5cm高时，剪掉上部叶片，剪取初始芽(高度保持在2cm3cm叶片数量在2片3片)，将其转入继代增殖培养基上培养。接入的茎段经过IOd20d培养，将增殖芽分株为单芽或小丛，继续转入继代培养基。继代转接代数不宜超过30代；培养条件同初代诱导培养。继代增殖培养基的筛选：基本培养基为MS,以6-BA：LOmg/L、2.0mg/L、3.0mg/L,NAA：0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L,TDZ：0、0.1mg/L、0.2mg/L为因素设计3因素3水平L9(34)的正交试验(表3)o表3山葡萄不定芽增殖影响因素正交设计表序号6-BANAAmgLTDZ11.00.2021.00.40.131.00.60.242.00.20.152.00.40.262.00.6073.00.20.283.00.4093.00.60.1（5）生根培养对继代丛芽进行筛选，选取生长健壮、芽高为3cm的单芽，在无菌条件下接种到生根培养基中，进行生根培养，培养15d20d,获取生长健壮的组培生根苗；生根培养基的筛选：基本培养基为1/4MS、1/2MS（改良MS基础上，蔗糖减半，即15g/L蔗糖）、改良MS,以IBA浓度（0.1、0.2.0.3mgL）、NAA浓度（0.2.0.3>0.4mgL）为因素设计3因素3水平L9（34）的正交试验（表4）o表4山葡萄生根试验影响因素正交设计表序号培养基植物生长调节剂mgLIBANAA11/4MS0.10.221/4MS0.20.331/4MS0.30.441/2MS0.10.351/2MS0.20.461/2MS0.30.27改良MS0.10.48改良MS0.20.29改良MS0.30.3(6)炼苗移栽：选取根数3条以上、根长达到Iem以上、生长健壮的组培生根苗，移到遮光度60%70%,环境温度2028°C室外育苗大棚炼苗10d15d,移栽前3d5d松开培养瓶盖，移栽时用清水洗掉根部培养基，移栽入育苗容器中，淋透水；(7)苗期管理：每天喷(淋)水1次2次，保持基质湿度80%90%o刚移栽的容器苗用遮阳网控制光照。移栽后一周内，透光度保持在30%40%,一周后逐渐增加光照，一个月后透光度增至70%80%；组培苗长出新叶后，每Iod喷施1次0.3%0.5%的复合肥(N:P:K=15:15:15)溶液，施肥后立即用清水冲洗叶面；生长后期施用磷、钾肥为主，出圃前100d停止施肥；施肥宜在傍晚进行，避免高温时施肥。病虫害防治遵循预防为主，综合防治的原则。(8)苗木出圃：待组培苗苗高达到20cm以上时，生长健壮、无病虫害的苗木可出圃造林。(9)数据统计与分析其中平均增殖系数=继代增殖后芽总数/初代芽个数；株平均根条数=生根条数/生根株数；生根率=生根株数/接种数。用Excel2016对数据进行整理，用SPSSl9.0对数据进行邓肯氏新复极差检测和方差分析。3.2 实验结果（1）消毒试验结果如表5所示，处理7,即山葡萄外植体在75%酒精消毒20s后，再经过0.1%升汞消毒20min,消毒效果较好，无菌活体得率均可达到66.67%。选用生长健壮无病虫害侵染的外植体较为重要。表5山葡萄茎段消毒试验结果处75%酒精消0.1%升汞消毒污染率未污染死亡率无菌活体理毒时间/s时间min/%得率/%11010100aOaOf2101580±1.28b2.96±0.74ab17.04±1.48e3102060.74±1.48c3.7±0.74ab35.56±1.28d4102555.56±1.28d11.85±0.74c32.59±0.74d5201065.18±0.74c3.7±0.74ab31.11±1.28d6201542.22±1.28e5.92±1.48b51.85±2.67c7202028.15±1.96g5.18±0.74ab66.67±2.57a8202522.22±1.28h16.30±1.96c61.48±0.74b9301034.07±1.96f62.96±1.48d2.96±0.74f10301520±1.28h65.93±1.96d14.07±2.96e11302018.52±3.23h77.04±2.67e4.44±1.28f1230257.41±1.96i88.15±3.23f4.44±1.28f（2）初代诱导培养试验正交试验结果如表6所示，处理6诱导率最高，达到79%。改良MS+2.0mgL6BA+0.2mgLNAA+30g/L蔗糖+4.0gL琼脂，PH值为5.8o由极差分析结果（表7）可知初代诱导培养各因素最佳水平组合如下：改良MS（水平2）+1.5mg/L6BA（水平2）+0.2mg/LNAA（水平l）o进一步对该最优组合进行试验，诱导率为81.05%。由主体间效应检测结果（表8、表9）可知基本培养基种类、6-BA、NAA浓度均对诱导率和愈伤率具有显著影响。表6山葡萄初代诱导培养影响因素正交试验结果序号基本培养基植物生长调节剂mgL诱导率愈伤率/%6-BANAA1MS1.00.245.00±2.31e14.77±0.73b2MS1.50.362.67±1.20bc12.57±0.73b3MS2.00.454.00±3.61d22.07±1.16c4改良MS1.00.368.33±1.86b11.10±1.27b5改良MS1.50.458.67±3.18cd6.67±1.30a6改良MS2.00.279.00±1.53a11.83±0.73b7B51.00.430.00±0.58f14.07±1.97b8B51.50.252.00±1.15d28.90±1.27d9B52.00.330.33±2.60f43.33±2.31e表7不同处理组合对山葡萄诱导影响的极差分析培养基6-BANAA诱53.89b47.78b58.67a导K268.67a57.78a53.78ab率%337.44c54.44ab47.56b/%R31.2210.0011.11愈Kl16.47b13.31b18.5b伤Kl9.87c16.04b22.33ab率%328.77a25.74a14.27a/%R18.9012.438.07表8主体间效应的检验（诱导率）源Ill型平方和df均方FSig.校正模型5415.778a6902.63014.079.000截距76800.000176800.0001197.920.000基本培养基4390.88922195.44434.244.0006-BA466.6672233.3333.640.045NAA558.2222279.1114.354.027误差1282.2222064.111总计83498.00027校正的总计6698.00026表9主体间效应的检验（愈伤率）源III型平方和df均方FSig.校正模型2717.687a6452.94817.378.000截距9108.03019108.030349.440.000MEDIUM1656.1802828.09031.771.000BA768.4472384.22314.741.000NAA293.0602146.5305.622.012误差521.2932026.065总计12347.01027校正的总计3238.98026（3）增殖培养试验正交试验结果如表10所示，处理4增殖系数最高，可达到5.06。即改良MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+0.1mgLTDZ+30gL白糖+4.0gL琼脂，PH值为5.8。由表11可知，增殖培养各因素最佳水平组合为：改良MS+2.0mg/L6-BA（水平2）+0.4mg/LNAA（水平2）+0.1mg/LTDZ（水平2）,利用该培养基进行增殖培养，增殖系数为5.24。由表12可知，BA,NAA,TDZ三因素均对结果产生显著影响。表10山葡萄不定芽增殖培养影响因素正交试验结果处理6-BANAAmgLTDZ增殖系数11.00.201.43±0.68f21.00.40.11.76±0.85f31.00.60.21.53±0.74f42.00.20.15.06±0.23a52.00.40.24.46±0.11b62.00.603.36±0.23c73.00.20.22.35±0.20e83.00.402.85±0.16d93.00.60.12.76±0.14de表11不同处理组合对山葡萄不定芽增殖的极差分析6-BANAATDZKl1.572.942.55K24.293.023.19增殖系数K32.652.552.78R2.720.470.64表12主体间效应的检验（增殖系数）源Ill型平方和df均方FSig.校正模型36.847a66.14137.314.000截距217.4871217.4871321.474.000NAA1.1562.5783.512.049BA33.771216.885102.597.000TDZ1.9202.9605.833.010误差3.29220.165总计257.62627校正的总计40.13826（4）生根试验正交试验结果如表13所示，处理5生根率和生根条数最多，即1/2MS培养基+0.2mg/LIBA+0.4mg/LNAA+蔗糖15gL+琼脂4gL,pH值为5.8。在此培养基与植物生长调节剂配比组合下，山葡萄生根率达到94.46%以上，生根条数可以达到5.39,主根粗壮。由表14结果可知，生根培养各因素最佳水平组合为：1/2MS培养基（水平2）+0.2mg/LIBA（水平2）+0.4mg/LNAA（水平3）+蔗糖15gL+琼脂4gL,PH值为5.8。由表15可知，基本培养基IBA,NAA,三因素均对生根率和根条数产生显著影响。表13山葡萄生根培养影响因素正交试验结果处理植物生长调节剂mgL根条数/条培养基IBANAA生根率/%±11/4MS0.10.254.22±0.74d3.47±0.20ef21/4MS0.20.369.56±0.68bc4.06±0.08cd31/4MS0.30.465.78±2.75c3.62±0.29def41/2MS0.10.373.96±2.83b4.72±0.15b51/2MS0.20.494.46±0.74a5.39±0.13a61/2MS0.30.274.82±2.47b3.16±0.09f7改良MS0.10.474.05±0.96b4.18±0.90c8改良MS0.20.271.22±2.21bc3.94±0.20cde9改良MS0.30.367.63±1.87c3.54±0.20def表14不同处理组合对山葡萄不定芽生根的极差分析生根率/%基本培养基IBANAA63.1967.4166.75K281.0878.4170.38网70.9669.4178.10根条数/条R17.8911.0011.353.724.123.52K24.424.464.1112-K33.893.444.39R0.701.020.87表15主体间效应的检验（生根率和生根条数）源因变量（%,条）III型平方和df均方FSig.校正模型生根率1222.47Ib4305.6184.017.014生根数8.453f,42.11310.113.000截距生根率138981.9031138981.9031826.705.000生根数433.9221433.9222076.654.000IBA生根率618.3132309.1574.063.031生根数4.90322.45111.732.000NAA生根率604.1582302.0793.970.034生根数3.55021.7758.494.002基本培养基生根率.000O生根数.000O误差生根率1673.8352276.083生根数4.59722.209总计生根率141878.20927生根数446.97227校正的总计生根率2896.30626生根数13.050263.3 结论（1）山葡萄茎段外植体消毒的最佳组合及时间为：75%酒精消毒20s,再经0.1%的升汞消毒20min,无菌活体得率可达66.67%。(2)初代诱导培养基配方为：改良MS+1.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30gL蔗糖+4gL琼脂，PH值为5.8,诱导率为81.05%。(3)继代增殖培养基配方为：改良MS+2.0mg/L6-BA+0.4mg/LNAA+0.1mg/LTDZ+30g/L蔗糖+4g/L琼脂，PH值为5.8,利用该培养基进行增殖培养，增殖系数为5.24。(4)生根培养基配方为：1/2MS培养基+0.2mg/LIBA+0.4mg/LNAA+蔗糖15gL+琼脂4gL,PH值为5.8,生根率为94.46%,生根条数539,主根粗壮。3.4 相关实验照片五、标准主要内容标准的主要技术内容包括10章:第1章范围：规定了标准的主要技术内容和适用范围。第2章规范性引用文件：说明了本标准引用文件的版本及规范性。第3章术语和定义：说明了本标准中的相关术语和定义。第4章外植体采集和处理：规范了外植体采集和处理标准。第5章诱导培养：规范了诱导培养条件及诱导培养基成分。第6章增殖培养：规范了增殖培养条件及增殖培养基成分。第7章生根培养：规范了生根培养条件及生根培养基成分。第8章炼苗移栽：规范了炼苗与移栽的条件。第9章苗期管理：规范了苗期水、肥、光照条件及病虫害防治。第10章苗木出圃：规范了苗木分级标准及出圃条件。第11章档案管理：规范了建档的主要内容。六、国内同类标准制修订情况及与法律法规、强制性标准关系本标准的编制依据现行的法律、法规和国家强制性标准，与这些文件中的规定不存在矛盾，协调一致。本标准内容和各项指标不低于国家强制性标准及国家推荐性标准。七、重大分歧意见的处理经过和依据本标准研制过程中无重大分歧意见。八、实施标准的要求和措施建议标准必须在遵循法律法规及国家相关标准的前提下，综合山葡萄组培苗生产的实际要求制定，标准必须具有法律依据及可操作性。由于目前并没有山葡萄组培苗生产的标准，故建议本标准发布实施后加强宣传、培训工作，该标准仍需根据实际情况及时加以修订和更新，以适应产业发展和技术进步的需要。九、自我承诺本标准内容与各项指标均不低于国家强制性标准、推荐性国家标准和行业标准。团体标准山葡萄组培苗生产技术规程标准编制工作组2023年6月15日