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细菌的基本结构不包括细菌基因组的结构和功能细菌和病毒一样同属原核生物，因而细菌基因组的结构特点在许多方面与病毒的基因组特点相似，而在另一些方面又有其独特的结构和功能。本节首先介绍细菌染色体基因组的一般结构特点，然后再具体介绍大肠杆菌染色体基因组的结构和功能。细菌染色体基因组结构的一般特点大肠杆菌染色体基因组的结构和功能细菌染色体基因组结构的一般特点（I）细菌的染色体基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成细菌的染色体相对聚集在一起,形成一个较为致密的区域，称为类核（nucleoid）o类核无核膜与胞浆分开，类核的中央部分由RNA和支架蛋白组成,外围是双链闭环的DNA超螺旋。染色体DNA通常与细胞膜相连，连接点的数量随细菌生长状况和不同的生活周期而异。在DNA链上与DNA复制、转录有关的信号区域与细胞膜优先结合，如大肠杆菌染色体DNA的复制起点（OriC）、复制终点（TerC）等。细胞膜在这里的作用可能是对染色体起固定作用，另外，在细胞分裂时将复制后的染色体均匀地分配到两个子代细菌中去。有关类核结构的详细情况目前尚不清楚。（2）具有操纵子结构（有关操纵子结构详见基因表达的调控一章）其中的结构基因为多顺反子，即数个功能相关的结构基因串联在一起，受同一个调节区的调节。数个操纵子还可以由一个共同的调节基因(regulatorygene)即调节子(regulon)所调控。(3)在大多数情况下，结构基因在细菌染色体基因组中都是单拷贝但是编码RNA的基因rrn往往是多拷贝的，这样可能有利于核糖体的快速组装，便于在急需蛋白质合成时细胞可以在短时间内有大量核糖体生成。(4)和病毒的基因组相似，不编码的DNA部份所占比例比真核细胞基因组少得多。(5)具有编码同工酶的同基因(isogene)例如，在大肠杆菌基因组中有两个编码分支酸(Chorismicacid)变位酶的基因，两个编码乙酰乳酸(acetolactate)合成酶的基因。(6)和病毒基因组不同的是，在细菌基因组中编码顺序一般不会重叠，即不会出现基因重叠现象。(7)在DNA分子中具有各种功能的识别区域如复制起始区OriC,复制终止区TerC转录启动区和终止区等。这些区域往往具有特殊的顺序，并且含有反向重复顺序。(8)在基因或操纵子的终末往往具有特殊的终止顺序,它可使转录终止和RNA聚合酶从DNA链上脱落。例如大肠杆菌色氨酸操纵子后尾含有40bp的GC丰富区，其后紧跟AT丰富区，这就是转录终止子的结构。终止子有强、弱之分，强终止子含有反向重复顺序，可形成茎环结构，其后面为PolyT结构，这样的终止子无需终止蛋白参与即可以使转录终止。而弱终止子尽管也有反向重复序列，但无polyT结构，需要有终止蛋白参与才能使转录终止。大肠杆菌染色体基因组的结构和功能大肠杆菌染色体基因组是研究最清楚的基因组。估计大肠杆菌基因组含有3500个基因，已被定位的有900个左右。在这900个基因中，有260个基因已查明具有操纵子结构，定位于75个操纵子中。在已知的基因中8%的序列具有调控作用。大肠杆菌染色体基因组中已知的基因多是编码一些酶类的基因，如氨基酸、喋吟、喀咤、脂肪酸和维生素合成代谢的一些酶类的基因，以及大多数碳、氮化合物分解代谢的酶类的基因。另外，核糖体大小亚基中50多种蛋白质的基因也已经鉴定了。除了有些具有相关功能的基因在一个操纵子内由一个启动子转录外，大多数基因的相对位置可以说是随机分布的。如控制小分子合成和分解代谢的基因，大分子合成和组装的基因分布在大肠杆菌基因组的许多部位，而不是集中在一起。再如，有关糖酵解的酶类的基因分布在染色体基因组的各个部位。进一步发现，大肠杆菌和与其分类关系上相近的其他肠道菌如志贺氏杆菌属(ShigeIla)、沙门氏菌属(Salmonella)等具有相似的基因组结构。伤寒沙门氏杆菌(SalmonelIatyPhimUriUm)几乎与大肠杆菌的基因组结构相同，虽然有10%的基因组序列和大肠杆菌相比发生颠倒，但是其基因的功能仍正常。这更进一步说明染色体上的基因似乎没有固定的格局，相对位置的改变不会影响其功能。在已知转录方向的50个操纵子中，27个操纵子按顺时针方向转录,23个操纵子按反时针方向转录，即DNA两条链作为模板指导mRNA合成的机率差不多相等。在大肠杆菌染色体基因组中，差不多所有的基因都是单拷贝基因，因为多拷贝基因在同一条染色体上很不稳定，极易通过同源重组的方式丢失重复的基因序列。另外，由于大肠杆菌细胞分裂极快,可以在20分钟内完成一次分裂,因此，携带多拷贝基因的大肠杆菌并不比单拷贝基因的大肠杆菌更为有利；相反，由于多拷贝基因的存在，使E.coli的整个基因组增大，复制时间延长，因而更为不利，除非在某种环境下，需要有多拷贝基因用来编码大量的基因产物,例如，在有极少量乳糖或乳糖衍生物的培养基上，乳糖操纵子的多拷贝化可以使大肠杆菌充分利用的乳糖分子。但是，一旦这种选择压力消失，如将大肠杆菌移到有丰富的乳糖培养基上，多拷贝的乳糖操纵子便没有存在的必要，相反，由于需要较长的复制时间，这种重复的多拷贝基因会重新丢失。大肠杆菌染色体基因组中,大多数rRNA基因集中于基因组的复制起点。riC的位置附近。这种位置有利于rRNA基因在早期复制后马上作为模板进行rRNA的合成以便进行核糖体组装和蛋白质的合成。从这一点上看，大肠杆菌基因组上的各个基因的位置与其功能的重要性可能有一定的联系。第1章细菌的形态与结构绪论一、选择题A型题L不属于原核细胞型微生物的是A.细菌B.支原体C.衣原体D.病毒E.放线菌2.下列微生物中，属非细胞型微生物的是：A.细菌B.支原体C.衣原体D.病毒E.放线菌3.属于真核细胞型微生物的是A.病毒B,细菌C.支原体D,立克次体E.真菌4.细菌属于原核细胞型微生物的主要依据是A,形态微小，结构简单B.原始核、细胞器不完善J二分裂方式繁殖D.有细胞壁E,对抗生素敏感5.关于非细胞型微生物，错误的是A.只由核心和蛋白质组成B,是最小的一类微生物C.核酸为DNA+RNAD.只能在活细胞内生长繁殖E.病毒为此类型微生物6.用自制的能放大270倍的显微镜第一次观察到各种形态微生物的是A.AntonyvanLeeuwenhoekB.LouisPasteurC.RobertKochD.EdwardJennerE.AlexanderFlemingX型题1.原核细胞型微生物不包括A.细菌B,真菌C.衣原体D.螺旋体E,病毒2.关于真菌，正确的是A.细胞核分化程度高，有核膜和核仁B.胞质内细胞器完整C真菌属于此类微生物D.核酸为DNA+RNAE.只能在活细胞内生长繁殖二、填空题12三、名词解释1.微生物2.真核细胞型微生物第一章细菌的形态与结构一、填空题1.测量细菌大小用以表示的单位是2 .细菌按其外形分为三种类型。3 .细菌的基本结构有三种。4 .某些细菌具有的特殊结构是四种。5 .细菌细胞壁最基本的化学组成是6 .革兰阳性菌细胞壁的化学组成除了有肽聚糖外，还有7 革兰阴性菌细胞壁的化学组成主要有和8 .菌毛分为和两种Q9 .在消毒灭菌时应以杀死作为判断灭菌效果的指标。10 .细菌的形态鉴别染色法最常用的是,其次是二、判断改错题L普通光学显微镜能看清细菌的形态，其放大的最佳倍数是400倍。2 .一个芽胞发芽成无数个繁殖体。3 ,细菌的中介体具有拟线粒体的功能。4 .细菌的L型是指细菌细胞膜缺陷型。5 .细菌细胞膜含有固醇类物质。三、选择题A型题L保护菌体、维持细菌的固有形态的结构是A.细胞壁B.细胞膜C.细胞质D.细胞浆E.包膜2.革兰阳性菌细胞壁中的磷壁酸的作用是A.抗吞噬作用B.溶血作用C,毒素作用D.侵袭酶作用E.粘附作用3.细菌核糖体的分子沉降系数为A.30SB.40SC.60SD.70SE.80S4.普通光学显微镜用油镜不能观察到的结构为A.菌毛B.荚膜C.鞭毛D.芽胞E.包涵体5.下列哪类微生物属于非细胞型微生物？A.霉菌B.腮腺炎病毒C.放线菌D.支原体E.立克次体6.下列中不是细菌的基本结构的是A.细胞壁B.细胞膜C.细胞质D.核质E,荚膜7.革兰阴性菌细胞壁中与致病性密切相关的重要成分是A.特异性多糖B.脂蛋白C.肽聚糖D.脂多糖E,微孔蛋白8.普通菌毛主要与细菌的A.运动有关B,致病性有关C.抗药性有关D.鉴别诊断有关E.遗传变异有关9.质粒是细菌的A,核质DNAB.胞质颗粒C.胞浆中核蛋白体D.核质（或染色体外）DNAE.中介体10.细菌细胞壁的主要成分是A.特异性多糖B.脂多糖C.肽聚糖D.磷壁酸E,核心多糖11.溶菌酶溶菌作用的机理是A.干扰细菌DNA的复制B.干扰细菌蛋白质的合成C.损伤细胞膜的通透性D.切断肽聚糖中多糖支架01,4糖昔键E.竞争合成细胞壁过程中所需的转肽酶12.细菌哪种结构的功能类似真核细胞的线粒体？A.核质B.核糖体C.中介体D.胞质颗粒E.质粒X型题L革兰阳性菌细胞壁的主要化学组成为A.脂蛋白B.肽聚糖C.脂多糖D.磷壁酸£核心多糖2.荚膜的功能是A抗吞噬作用B.抗干燥作用C.抗有害物质的损伤作用D.与细菌鉴别有关E.与某些细菌的分型有关四、名词解释L荚膜（CaPSUIe）2.芽胞（SPore）3.鞭毛（flagellum）4.菌毛（PilUS）5.质粒（plasmid）6.L型菌五、问答题1试述革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁化学组成与结构的异同点。6 .试述GramStain染色法及其意义。绪论参考答案一、选择题A型题1.B2.D3.C4.C5.C6.AX型题LBE2.ABCD二、填空题：L细菌、支原体、衣原体、螺旋体、立克次体、放线菌2.原核，非细胞，真核三、名词解释L微生物：是众多个体微小、结构简单、肉眼直接看不见必须借助光学显微镜或电子显微镜放大数千倍，甚至数万倍才能观察到的微小生物。2.真核细胞型微生物：细胞核的分化程度高，有核膜、核仁；胞内细胞器完整的微生物。第一章参考答案一、填空题L原核细胞型微生物真核细胞型微生物非细胞型微生物2.细菌放线菌支原体衣原体立克次体螺旋体3.真菌4.病毒二、判断改错题L错，缺乏完整的细胞器。2 .错，细胞器完整。3 .错，只含一种核酸。三、选择题A型题1.C2.C3.DX型题1.ABCDE2.ABC四、名词解释1.医学微生物学：主要研究与医学有关的病原微生物的生物学特性、致病性与免疫机制，以及特异性诊断、防治措施，以控制和消灭感染性疾病和与之有关的免疫损伤等疾病，达到保障和提高人类健康水平目的的一门学科。2.菌株：是指从不同来源或从不同时间或地区所分离的同一种细菌。五、问答题1.答：根据微生物的大小、结构、化学组成可将其分为以下三大类：（1）原核细胞型微生物：仅仅只有原始的核质，无核膜、核仁，缺乏完整的细胞器，只有核糖体，DNA和RNA同时存在。它包括细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体。（2）真核细胞型微生物：细胞核的分化程度高，有核膜和核仁，胞质内细胞器完整。如真菌属于此类。（3）非细胞型微生物：是最小的一类微生物，结构简单，只有一种核酸（DNA或者是RNA）存在。缺乏完整的酶系统，必须要在活细胞内增殖。如病毒属于此类。2,答：革兰染色的主要步骤、结果及实际意义如下：（1）革兰染色的主要步骤：涂片、干燥、固定；染色：初染、媒染、脱色、复染。（2）结果：革兰阳性菌呈紫色，革兰阴性菌呈红色。(3)意义：经革兰染色可将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌，有助于鉴定细菌，用来指导临床选择药物，有助于研究和了解细菌的致病性等。细菌的特殊结构细菌的特殊结构有荚膜、鞭毛、菌毛和芽胞。1 .荚膜：荚膜是某些细菌在细胞壁外包绕的一层界限分明，且不易被洗脱的粘稠性物质，其厚度20.2以m,为荚膜；厚度荚膜对碱性染料的亲和性低，不易着色，普通染色只能看到菌体周围有一圈未着色的透明带；如用墨汁作负染色，则荚膜显现更为清楚。其成分多为糖类，用荚膜染色法于光学显微镜下可见菌体外一层肥厚的透明圈。其功能是：对细菌具有保护作用；致病作用；抗原性；鉴别细菌的依据之一。2 .鞭毛：鞭毛是由细胞质伸出的蛋白性丝状物，其长度通常超过菌体数倍。弧菌、螺菌及部分杆菌具有鞭毛。鞭毛纤细，长320以m,直径仅100nm,不能直接在光学显微镜下观察到。经特殊的鞭毛染色使鞭毛增粗并着色后,才能在光学显微镜下看至小也可直接用电子显微镜观察到。按鞭毛数目和排列方式，可分为：周鞭毛，菌体周身随意分布的许多鞭毛；单鞭毛，位于菌体一侧顶端仅I根鞭毛；双鞭毛，位于菌体两端各I根鞭毛；丛鞭毛，位于菌体极端有数根成丛的鞭毛。其功能是：鉴定价值，鞭毛是细菌的运动器官，细菌能否运动可用于鉴定。致病作用：鞭毛运动能增强细菌对宿主的侵害，因运动往往有化学趋向性，可避开有害环境或向高浓度环境的方向移动。抗原性：鞭毛具有特殊H抗原，可用于血清学检查。3 .菌毛：许多革兰阴性菌和个别阳性菌，细菌表面有极其纤细的蛋白性丝状物，称为菌毛。菌毛比鞭毛更细，且短而直，硬而多，须用电镜才能看到。菌毛可分为普通菌毛和性菌毛两类。(1)普通菌毛：该菌毛遍布整个菌体表面，形短而直，约数百根。普通菌毛是细菌的粘附器官，细菌藉菌毛的粘附作用使细菌牢固粘附在细胞上，并在细胞表面定居，导致感染。(2)性菌毛：性菌毛比普通菌毛长而粗，仅有I10根，中空呈管状。通常把有性菌毛的细菌称为雄性菌(F+菌)。无性菌毛的细菌称为雌性菌(F-菌)。带性菌毛的细菌具有致育性，细菌的毒力质粒和耐药质粒都能通过性菌毛的接合方式转移。性菌毛能将F+菌的某些遗传物质转移给F菌，使后者也获得F+菌的某些遗传特性。细菌的抗药性与某些细菌的毒力因子均可通过此种方式转移。4 .芽胞：芽胞是某些细菌（主要是革兰阳性杆菌）在一定条件下，细胞质、核质脱水浓缩而形成的圆形或椭圆形的小体。由于芽胞对热、干燥、辐射、化学消毒剂等理化因素具有强大抵抗力，故在医学实践中具有重要意义：抵抗力强的芽胞可在自然界存活多年，成为某些疾病的潜在传染源；特别注意能形成芽胞的细菌污染了病房、手术室等，必须封闭房间进行彻底灭菌；因芽胞对理化因素的抵抗力强，故可以芽胞是否被杀死而作为判断灭菌效果的指标；细菌芽胞的形状、大小、位置等随菌种而异，具有重要鉴别价值。其功能是：芽胞的抵抗力很强；芽胞在适宜条件可以发育成相应的细菌；鉴定细菌的依据之一。基于免培养法的中高温大曲细菌群落结构研究2O13年第41卷第8期叶光斌，董瑞丽，王彩虹，等.基于免培养法的中高温大曲细菌群落结构研究J.江苏农业科学，2O13,41（8）：333-336基于免培养法的中高温大曲细菌群落结构研究叶光斌，一，董瑞丽，王彩虹，王毅，熊俐，罗惠波，沈才萍（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川自贡643000；3.四川省攀枝花市产品质量监督检验所，四川攀枝花617000；4.泸州老窖股份有限公司，四川泸州646000）摘要：通过构建细菌16SrRNA基因克隆文库、测序及构建系统发育树，对泸州老窖中高温大曲的细菌群落结构进行了研究O结果表明：中高温大曲的细菌组成较为丰富，且大部分与可培养的细菌类群相关，主要分布于芽狗杆菌纲、梭菌纲以及放线菌纲。其中芽泡杆菌纲内克隆子多样性最为丰富，主要包括乳杆菌属、乳球菌属、魏斯氏菌属、芽抱杆菌属、明串珠菌属、片球菌属和高温放线菌属；放线菌纲内克隆子分布于糖多抱菌属；梭菌纲内克隆子分布于Symbi-obacterium和一个属级分类地位未知的梭菌纲内。中高温大曲内细菌的优势种群为魏斯氏菌(占全部克隆子比例的30.35%,2OTUs)高温放线菌(28.57%,2OTUs)和乳杆菌(19.65%,6OTUs)O关键词：中高温大曲；免培养法；细菌；16SrRNA基因文库中图分类号：Q936文献标志码：A文章编号:1002-1302(2013)08-0333-04曲为酒之骨，中高温大曲作为浓香型白酒发酵的糖化、发酵剂，含有多种微生物及酶类，在浓香型白酒发酵过程1.5molLNaCl,1%cTAB,调PH值至8.0)重悬，放置于37。C摇床中225rmin水平振荡30min；(3)加入3mL10%SDS,在65温浴15min,之后将离心管置于一80超低温冰箱放置1 5min,再将离心管转移到65水浴锅放置2 5min,如此重复3次，以促进细胞破裂；(4)4下6OOOg离心1Omin,上清转移到新的3OnI匕离心管中；(5)加等体积酚一氯仿一异丙醇(体积比25：24：1),剧烈振荡5min,静中具有重要的作用。早期学者对于大曲微生物的研究主要集中在采用传统微生物培养方法对大曲中可培养微生物进行分离、鉴定、利用，以及针对大曲发酵过程中可培养微生物的菌群演绎规律的研究等方面。近年来，随着分子生物学的迅猛发展，分子生物学很快被引入到大曲微生物生态学的研究当中。胡佳等利用DGGE及16SrRNA基因克隆文库技术，研究了中高温大曲内细菌微生物的群落组成；高亦豹等通过PCRDGGE技术比较分析了不同香型大曲的微生物群落组成，发现了很多未见报道的微生物类群；罗惠波等通过置Iomi后，130008离心3 0min；(6)将上层水相移人新的离心管，加入0.6倍体积异丙醇，于室温沉淀lh；(7)室温下130008离心20min,弃上清；(8)用枪吸除残余的异丙醇液体，加入100070%乙醇，并转移至2m匕离心管内，静置IOn)in,4oC下130008离心15min；(9)重复以上1次；(10)SSCP.Biolog技术分析了大曲发酵过程中微生物的群落动态变化规律Jo泸州老窖生产用曲是浓香型大曲的典型代表,在白酒行业具有较为广泛的市场，本研究以泸州老窖生产弃上清,用枪吸除残余的乙醇,置于超净台吹风1Onlin,除尽乙醇，直到不能闻到U乙醇气味；(11)加入50l0OIXL无菌双蒸水，放置到65水浴锅水浴1h,促进DNA的溶解。粗提的大I出DNA通过PCR产物纯化试剂盒(OMEGA公司)纯化，纯化后的DNAPCR扩增效果良好。2细菌16SrRNA基因克隆文库的构建与测序引物对Eub27F(5AGAGTITGATCCTGGCTCAG3)/用曲为研究对象，通过构建细菌16srRNA基因克隆文库、测序及系统发育树分析技术，确定大曲中细菌种群组成，从而为后期功能微生物的分离及应用提供基础数据。1材料与方法1.1样品采集与DNA提取Eub1492R(5CGGTTACCTTGTrACGACTF-3)用于细菌165rRNA基因的扩增。PCR扩增条件为：94变性4min；94Oc变性45s、55退火45s、72延伸60s,30个循环；720c延伸10mino为了防止PCR偏差，混合3次重复的PCR产物，通过胶回收柱(0MEGA公司)回收纯化，纯化后的中高温大曲采集自泸州老窖的生产用曲。DNA提取采用改良自ZhoU等的DNA提取方法，简要的提取步骤如下：(1)称取35g大曲置于灭过菌的碾钵内，加入石英砂和液氮反复研磨3次后，收集至U30位灭菌的离心管内；(2)加入13.5mLDNA抽提缓冲液(100mmolLTris-HC1100mmol/LEDT-Na2,10Ommo1/L磷酸钠缓冲液，PCR产物连接至iJpMD18T载体（TaKaRa公司）上，再转化到大肠杆菌DH5感受态细胞内，涂布于LA平板；37培养16h后，用灭菌的牙签随机挑取克隆子划线于新的LA平板上。再通过菌落PCR确定阳性克隆子，引物对UPIcsggaaacagctaagaccatG3）up11（5ttgggta一收稿日期：2013-07-24基金项目：四川省教育厅重大培育项目（编号：09ZZ015）；四川理工学院人才引进项目（编号：2010XJKRL001）；酿酒生物技术及应用四川省重点实验室开放课题（编号：NJ201005、NJ2011-05）。Acgccagggt-3）用于菌落PCR扩增，扩增程序同上。随机挑取58个细菌阳性克隆子送往上海杰李生物技术有限公司进行测序，将测序结果通过DNAMAN软件进行比对，统计相同或相似序列的数目。作者简介：叶光斌（1980），男，安徽池州人,博士,讲师，从事酿酒生物技术及应用的教学与研究。E-mail：guangbinl980126.conor.-一一334.-江苏农业科学2013年第41卷第8期表1中高温大曲细菌16SrRNA基因克隆文库物种多样性和丰富度评估1.3克隆文库的统计分析及系统发育树的构建通过Be1IeroPhorl软件在线去除嵌合体序列(http：/compbio.anu.edu,att/belIerophon/belIerophon.pl)。对于16SrRNA基因序列，采用序列相似性大于等于97%,定义为同一OTU(operationaltaxonomic&115,运算的分类单位)Jo每个0TU选取1个代表克隆子序列与NCBI(美国国立生物信息中心)数据库(http：/blast,ncbi.n1m.nih.gov/Blast.csi)进行注：一般Shannon-Wiener指数越高，则文库所含克隆子多样性比对，查找近似微生物或环境克隆子分类信息和序列信息(一般选择有参考文献的序列)选取各0TU代表克隆子及网上数据库比对的近似序列构建系统发育树，通过ClUStalX(VersionL87)软件对齐序列后，再通过MEGA4软件构建系统发育树。21个细菌克隆子的16srRNA基因序列已上传至NCBl的GenBank数据库，序列号为KF444925KF4449450采用文库覆盖率方法、ShannonWiener指数、Simpso口指数、BuzasGibson均一度指数和稀释曲线(RarefractionCUrVe)对所建文库进行评估。其中文库覆盖率通过文献9的方法计算；Shannon-Wiener多样性指数、Simpa S G i b s o n 均一度指T 软件（h t t p ：/ /n o / o h ammo r/ pn多样性指数、Buz数和稀释曲线通过PASfolk,uio.ast/)计算获得。稀释曲线通过软件SigmaPlot11.0绘制。2结果与分析2.1克隆文库的评估辍己L ()越高；SinlPSon指数(1一D)越接近1,则文库所含克隆子多样性越高；s。n均一度指数越接近1,则文库中克隆子分布越平均Lo克隆子数量图1中高温大曲细菌16SrRNA基因克隆文库的稀释曲线每个0UT的代表克隆子的分布及比对信息见表2。从比对结果中可以看出：克隆子与参比序列间相似度较高，为96%99%,它们大多数与可培养微生物相关。共有19个代表克隆子参与构建系统发育树，通过分析系统发育树及克隆子比对信息，可以很直观地看出大曲内细菌群落主要分布于芽抱杆菌纲、梭菌纲及放线菌纲。其中芽泡杆菌纲克隆子多细菌16SrRNA基因克隆文库的测序结果表明，细菌克隆内物种多样性较为丰富，在所分析的58个阳性克隆子中，有2个嵌合体，同源性小于97%的克隆子达到19类。细菌文库覆盖率达到66.O7%（表1）,从稀释曲线（图1）可以看出，细样性最为丰富，共有15OTUs,克隆子数目约占全部克隆子总数的92.8%,且大多数克隆子属于乳杆菌目分类单元下的属种（图2）,如魏斯氏菌属（WeiSSdlaconfusa,IV.paramesente.roides）、孚L杆菌属（LaCtobaCi1IuscrustOrum,Lplantarum,Lpon一菌16srRNA基因克隆文库未达到饱和。尽管未能完整获得大曲内所有细菌的种群组成信息,但该数据基本反映了浓香型中高温大曲内主要细菌的群落组成，具有一定参考价值。2.2中高温大曲细菌群落结构的分析廊，LrOssiae）>孚L球菌属（LaCtOCOCCuslactissubsp.1actis）>明串珠菌属（LeUCOnoStoCspp.）>片球菌属（PediC）COeCUSPentosaceus）。表2中高温大曲细菌16SrRNA基因文库内测序克隆子比对信息注：克隆子tZQX-43由于只测引物Eub1492r端序列，故未将其纳人系统发育树的分析。江苏农业科学2013年第41卷第8期335-系统发育树采用Mega4软件的邻接法(Neighbor-JOining),JukesCantor式下自举1000次获得；图中带有标记的为本次研究获得的克隆子序列，括号内数值为该类型的克隆子数目。图2中高温大曲细菌克隆子16SrRNA基因系统发育树.336江苏农业科学2013年第41卷第8期制曲温度存在一定关系，制曲品温越高，则高温放线菌属和芽抱杆菌的分布越丰富。3结论其余的类群包括地衣芽泡杆菌(Baci11uslichenrmis)>高温放线菌属(ThermoactinomycesvuIgaris)和一个属级分类地位未知的高温放线菌科细菌。梭菌纲克隆子主要分布于SyInbiobaCterium属内和一个属级分类地位未知的梭菌纲细菌。放线菌纲克隆子分布于糖多抱菌属(SaccharOPOlyspOraspp.)o总体而言，中高温大曲内的优势微生物为魏斯氏菌(占全部克隆子比例的30.35%,2OTUs),高温放线菌(28.57%,20TUS)和乳杆菌(19.65%,6OTUs)o目前已有很多关于中高温大曲细菌菌群组成的报道,其通过构建中高温大曲细菌16SrRNA基因克隆文库、测序和系统发育树分析，较为系统地研究了泸州老窖成品大曲的细菌微生物群落结构，研究结果表明：乳酸菌（魏斯氏菌和乳杆菌）和高温放线菌是中高温大曲内细菌的优势种群。后期的工作应集中在如下几点：一，针对乳酸菌和高温放线菌，中高亦豹等通过PCR-DGGE技术比较了不同香型大曲样品（其中包括中高温大曲样品：汤沟大曲和剑南春大曲）内的细菌群落组成，结果表明大曲内细菌优势种群为魏斯氏菌和乳杆菌，且Thermoactinomycessanguinis仅存在于高温大曲中J。而胡佳等利用DGGE及16SrRNA基因克隆文库对设计相关培养基，进行分离、培养及代谢性质的研究，确定其在白酒固态发酵过程中的具体作用。二，比较不同地区、不同季节、不同香型大曲间微生物的差异，以研究地域季节、制曲工艺等对大曲微生物组成的影响。通过以上数据的整合和比较研究可以帮助我们在理解曲定香型等方面提供理论依据。三,在大曲质量评判上，重新评估大曲酸度指标（或者乳酸含量指标）对大曲质量评判的重要性。参考文献：1胡佳，邓斌，张文学，等.浓香型白酒曲药中细菌组成及系统岩.利用pcR-DGGE未培养技术对中国于中高温大曲内细菌微生物群落组成的研究认为：变形杆菌亚门的和PSeUdomOnas、放线菌门的NocardiopsiS和Ar-throbacter拟杆菌门的Dysgonomonas以及部分不可培养的IBProteobacteria拟杆菌门细菌是大曲内的优势种群本试验结果中关于大曲优势细菌为魏斯氏菌、乳杆菌的这一结论与Wang等的结论较为一致；所不同的是，在具体的细菌微生物属种组成上存在一定差异。此外，在我们的样品中还存在较高比例的高温放线菌的分布，且主要是普通高温放线菌(Thermoactinomycesvulgaris和ThermoactinomycessP.)，这可学分析J.酿酒科技，2007(5)：17-19.2高亦豹，王海燕，徐白酒高温和中温大曲细菌群落结构的分析J.微生物学通报，2010,37(7)：999-1004.能是由于2组数据所研究的样品、试验方法等的不同而导致的。3WangHY,GaoYB,FanQW,etal.CharacterizaitOnandcomparisonOfmicrobia1communityofdiferenttypicalChinese1iquorDaqusbyPCR由于本次研究获得的克隆子信息大多与可培养微生物近似，因此有必要具体分析这些微生物在白酒酿造中的生态学功能。从图2可以看出，乳杆菌目的克隆子包括WeIssellacolzfla、pameSenteroidesLactci1Iuscrustorum>tarUn1、Lpontis、L.roaeLactococcsIactubsp.Iact/LeminAppiedMirobiology,201153：134-140.4罗惠波，黄治国，李浩，等.浓香型大曲原核微生物群落的PCRSSCP解析J.微生物学通报，2009,36(9)：13631367.5罗惠波，黄治国，李浩，等.浓香型大曲微生物群落代谢多样性研究J.西南大学学报：自然科学版，2009,31(7):18O-184.6ZhouJZ,BrunsMA,71删©JM.DNArecoveryfromsoilsfOdiverseC01"t05¥0Cspp.、PediococcuspentOsaceus这些具有产乳酸能力的乳酸菌类群，初步推断这些微生物可能来源于小麦或稻草。composiitonJ.ApplEndmnMicmbiol,1996,62：316-322.7all,eDJ.NucleicacidtechniquesinbacteiralsystematicsM.NewYork:Wiley,1991：115-175.高亦豹等对于浓香型大曲及白酒酒醋内细菌的研究中均报道了亚eisseUa和Lactobacillus类群的存在。'J,本研究结果与其较为一致；此外刘莉萌等报道了片球菌(Pediococcus)在窖泥内的分布，表明大曲是浓香型白酒乳酸发酵的菌种来源，且部分窖泥片球菌可能来源于大曲。浓香型白酒生产强调增己降乳沈怡方对于大曲内乳酸菌的论述也认为乳酸含量可以多少反映曲质，且提高大曲发酵的品温可以减少乳酸菌含量。本研究结果表明中高温大曲内乳酸菌是优势8MeCaigAE,GloverLA,ProsserJI.MoleeularanlaysisfobaeteiraleommunityStrueturendadiversityinunimprovedandimprovedUplndagrasspasturesJ.App1EnvironMierobioll999,65：1721 -1730.9叶光斌，王风平，肖湘.东太平洋中国多金属结核区镒结核样品中微生物群落结构的研究J.台湾海峡,2010,29(2)：218-227.10王海燕，张晓君，徐11刘莉萌,张岩,等.浓香型和芝麻香型白酒酒酷中微生物菌群的研究J.酿酒科技，2008(2):86-89,91.斌，东秀珠，等.浓香型白酒窖池中片球菌的分离与鉴定J.酿酒科技,2007(2)：22-24,28.种群，且以杆菌为主，因此有必要在大曲生产中通过提高制曲品温等配套措施以控制乳酸菌的生长。此外，本研究中发现高温放线菌属在所研究的大曲内也存在较高分布。高温放线菌属由于具有菌丝体等形态学特征，在早期的分类中将其归人放线菌目；然而基于16srDNA序列分析、G+C比等其他分子生物学研究结果，且具有内生12王茂，赵辉，陈凤阁.浓香型白酒窖泥中乳酸菌的分离与初步鉴定CJ.酿酒科技，2006(4)：2 9-31.L13沈怡方.白酒生产技术全书M.北京：中国轻工业出版社，2009：47.抱子(含有二毗咤竣酸)，目前有学者建议将该属并入枯草杆菌菌群。其中ThermoactinomyceSVUlgar最早报道时就发Ll4:李文均，张忠泽，姜成林.高温放线菌属分类研究进展J.微生物学报，2002,42(6)：759-763 .15KuoMJ,HartmaniPA.IsOlatiOnOfamy1O1ytiestrainsfothermoaetinmyeesvulgarisandproductionfothermophi1ieactinomyceteamy1a现该菌具有较强耐高温和产淀粉酶的能力。高亦豹等的数据表明，高温放线菌属只存在于高温大曲内。结合本研究结果，有理由相信高温放线菌属和芽胞杆菌的分布与大曲sesJ.Jounar1OfBacterioloy,g1966,92：723726