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2023下呼吸道感染宏基因组二代测序报告临床解读路径专家共识（最全版）近年来，宏基因组二代测序（mNGS）技术在下呼吸道感染（LRTI）病原诊断领域得到了广泛应用，国内临床医师在mNGS的临床应用方面已积累了一定的经验和证据。但mNGS在LRTI病原诊断中的适用场景仍缺乏规范，mNGS报告的临床意义解读也缺乏专业的指导意见。本共识基于mNGS在我国LRTI病原诊断方面的应用实践，梳理mNGS在LRTI应用领域的瓶颈问题，汇总本领域专家意见，明确了mNGS在LRTI病原诊断中的适用场景为mNGS报告临床意义提供了一条合理可行的解读路径，以期规范mNGS在LRTI中科学合理应用。宏基因组二代测序（metagenomicnext-generationsequencing,mNGS）是近年来兴起的基于核酸检测的微生物鉴定技术,由于其非预设性、高通量等优点而得到广泛应用U-4下呼吸道感染（IOWerreSPiratoryt3CtinfCtlOZLRTl要包括社区不犬得性肺5（COmmUnity-acquiredpneumonia,CAP）、医院获得性肺炎（hospital-acquiredpneumonia,HAP）、免疫抑制宿主肺炎、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管扩张症合并感染等类型，临床表现多样，感染微生物种类复杂，感染和定植鉴别困难，加之mNGS技术本身存在的局限性，mNGS诊断效力的发挥有赖于选择恰当患者、采用适宜标本以及进行合理的解读。尽管国内就mNGS的技术要点和临床应用已有数部专家共识，但尚缺乏针对LRTI临床实践中具体问题的指导意见。为此，中华医学会呼吸病学分会发起并组织呼吸与危重症、临床微生物检验、感染等多学科的专家撰写本共识，以期规范mNGS在LRTI中的临床应用，为更好地规范解读mNGS报告提供指引。LRTl诊断要点、主要病原谱及特定致病微生物的危险因素本共识不再赘述，可参考相关指南或共识3-71。本共识采用问答的形式，首先提出需要阐明的问题，经共识写作组讨论后确定入选问题，在梳理临床证据的基础上给出每个问题的推荐意见及理由，并附上典型应用案例及其解析，方便读者掌握共识要点。本共识适用于青少年和成人LRTIo一.LRTl病原学诊断方法学问题1:mNGS和传统微生物检测方法相比的优势与不足是什么？传统微生物检测方法技术成熟，可靠性较高，临床应用实践多；mNGS技术理论上能非预设性、一次性检测未知病原，检测范围更广，但存在技术复杂、报告解读困难等不足。与传统微生物学检测方法相比,mNGS的优缺点见表18中。不同的病原学诊断方法都有其各自的适用场景与前提，需要根据患者群体、病情特点、可疑病原微生物类别、当地实验室条件，选择适宜检测方法。»I-NGSfn传统微生物学愉利方法汴IJm原学诊嘛中的优静与不足优暂不足*na(I)“必度空嫌帕样本中原生与叙俄多少的彰明.2),隹目便3,除色便皇«««才级仅得na的用tCMat懵IKB做下令3他，色力也“似生，奥蟒X4,设务筌六条科限.MTHJ5)以WG样，笛灸O剧况曲牌1蠹然盛噩方世小网。色方加S在杆需要仪米值月做星。T；9的水殳慢作X峻皎的重丽大(5.然察做1将卜仇也过雷MWt反a行切.防(6虏濡瞿I)伯格相“*中力方法学收熟.方便开展(I>，使用Mfli西拘口弘度m壮>实*室离要忏<1不同的q*或删不X的精养船力精3)箫存必削除会1.构是事0件改物珍新的金标序4)篇岸出需即强支等可RIT用/K险指愤0球阳死祚方也依馒作者建心(3由球上口号“*埸开嗫仪&A鼻体.文克次体等弟*总多像“声无心笆培伟般我要IcdVtt5fttH*-t<lKit.W三KrjMM（HW或IUl）<)ttfa>(>uB*露E亶/工嚣器恸窗号翳/三m检薄的病硼取毒号(3)t>X度a”多叟分子生物学松丽± 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.聚集性发病疑似具有传染性、但无法明确病原体的LRTI;有特殊病史（如近期境外或野外旅游史）且经验性治疗无效,病情较为严重的LRTI;临床考虑特殊病原体（如钩端螺旋体、嗜肺军团菌、鹦鹉热衣原体等）感染且病势迅疾或迁延者，常规培养困难或所在医疗机构无法提供可靠的传统检测方案时。4 .患者有LRTI症状或影像表现，经规范抗感染治疗后病灶吸收延迟、病程迁延，需鉴别是否由非感染性疾病所致（如结缔组织疾病的肺部累及、肺淋巴瘤等），可以在常规病原微生物检测、感染生物标志物、病理等相关检查同时送检mNGS以帮助鉴别诊断。问题3:哪些临床场景通常不建议送检mNGS?1 .免疫功能健全宿主罹患LRTI（包括重症肺炎），经过规范的经验性抗感染治疗病情已好转。2 .LRTI已通过其他方法获得病原学结果，与临床特点相符，或针对性治疗有效。3 .无法获取优质标本。问题4:如何根据所在医院微生物检测能力差异化送检mNGS诊断LRTI?mNGS技术本身具有价格昂贵、技术复杂、结果解读难度大的特点，不建议mNGS替代传统生物检测。在传统微生物检测能力不足的医疗单位,对于疑难、复杂或危重感染病例，可以考虑将mNGS作为传统的补充手段。原则上应首先针对可疑病原微生物选择可靠的检测方法，包括PCR等特异性的分子检测，但在缺乏相应检测手段的情况下，可将mNGS作为备选。例如，疑诊病毒性肺炎期E典型病原体肺炎患者,应首选针对常见呼吸道病毒和非典型病原体的PCR或多重PCR和（或）抗原检测,在常规检测阴性或本机构无法进行相关检测时,可将mNGS作为重症患者的选择。三标本选择、采集和运送规范及质量评估问题5:如何根据LRTI特点选择mNGS送检标本类型？在LRTI的病原微生物诊断中，可用于mNGS检测的标本包括痰（含诱导痰）、气管吸引物、支气管肺泡灌洗液（bronchialalveolarlavagefluids,BALF）、经支气管肺活检（transbronchialIungbiopsy,TBLB）标本、经支气管内超声（endobronchialultrasonographyzEBUS）活检标本、经皮肺穿刺活检标本、血液等I"2。选择mNGS送检标本类型时应考虑下列因素：（1）标本中的病原微生物载量；（2）标本中污染或定植微生物的含量及其对检查结果的干扰；（3）标本中人源序列的含量及其对检测结果的干扰；（4）标本采集的难易程度及相关操作风险;（5）标本采集所需要的医疗费用。表2比较了常用呼吸道标本的临床适用场景。«2LRn患弄总吸mNGS#川标本的比较标A中致病徵生物的*效利Xi物的t扰造用餐床场景Wn中心气道区域SB金气道内明崂现性为0患%的合I（Htt嘉女Q齐的悚本,我我4 生物&&较低存在比较严重的口 Ir呼啜电人气道定怆生物F优邛蕊蕊,耀人*核饿lit应期爰或气管内啜引钝GS检费建立 为炎辆电学仅e1的峪床仔第尚4、充分. 枝问睡足0口区分定怆或村生 打“ 因超类标MHTmX.S股湾 应L格拿运应吁雨口仅限了高班量 的.源剜上.今格疑麻木住限用象力决的患X«0 右载人I二ifl 的"喂食5，者. 出HM片的患 局室）；而气管内啜引物标本取Fn 丁已 g【气道同不Ie酎受支气管馀 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.mNGS送检标本的保存要求：（1）下呼吸道标本：包括痰（含诱导痰）、BALF、肺炎旁胸腔积液等，原则上应在采集后立即送检。若标本不能立即送检，标本采集时间与检测时间间隔24h,可在28。（:保存。若标本采集时间与检测时间间隔24h,DNA测序标本保存时间2周时可储存在-20OC冰箱，保存时间超过2周则需储存在-80OC冰箱;需要进行RNA测序的标本如果保存时间24h,均应保存在-80。（:冰箱。对于短期不做检测的液体样本,冻存前应分装保存在冻存管（500l管）中。（2）血标本：采集后4OC保存不超过8h,如果需要长期保存,分离血浆后4。（:可保存24h,长期保存于-80。（:冰箱。（3）组织标本：来自感染部位的穿刺或手术切除组织标本,应保存在无菌生理盐水或者Hank,s液中，4OC保存不超过24ho如果需要长期保存，小块组织可以不加保存液立即-80OC冻存，穿刺活检标本置于无菌生理盐水-80。（:冻存。3 .标本的运输要求：（1）24h内送抵实验室并开始检测，可考虑冰袋低温运输；（2）2472h内送抵应干冰运输，送抵后应立即进行标本前处理和核酸提取。4 .需要进行去宿主核酸处理的标本保存和运输注意事项：除了上述注意事项外，此类标本一般要尽量保证病原微生物完整性，避免碾磨或多次冻融。问题7:哪些LRTI需要在进行DNA测序的同时送检RNA测序？RNA病毒（附表1）弓|起的LRTI通常有一定的季节性、流行性或地域性。建议检测方法首选单重或多重PCR检测或相应的抗原检测【2021J。若当地医疗机构无相应检测能力，或PCR检测阳性但依然高度怀疑时，可在送检mNGSDNA测序的同时进行RNA测序。下列临床情况可供参考：（1）呼吸道RNA病毒感染流行季节（主要是冬春季节以及南方的夏季）、有相应流行病学史的患者出现疑似呼吸道病毒感染的临床和（或）影像表现。（2）LRTI合并以下情况时：免疫抑制宿主；发热伴严重血小板减少或凝血功能障碍；急性肝肾功能损害；急性神经系统症状。四.mNGS的关键实验室技术参数问题8:mNGS检测报告需要关注哪些内容？mNGS检测报告从检测技术角度应包括如下内容：标准化后的微生物特异性读长（reads）数/序列数、标准化中英文名称、相对丰度、阈值、基因组覆盖度图。可选内容有：相应部位病原微生物列表、微生物序列与人源核酸序列的比值、测得总序列数、质量合格序列数、可比对至微生物数据库序列数、测序质控图、耐药基因、毒力基因等。报告微生物的版块可按细菌、病毒、真菌、寄生虫、特殊病原体（支原体、衣原体、立克次体等）5大类分别列举。主要参数定义及其意义：（1）reads:测序仪单个测序反应所得到的碱基序列，二代测序平台T殳长度为5075bp的片段。（2）reads数：指测序获得的某种微生物属/种碱基序列的数量。病原微生物属/种水平上检出的reads数与当次实验的总测序数据量直接相关，为避免总测序数据量高低的干扰，应对检出reads数进行标准化之后进行报告。（3）覆盖率：指达到给定深度的测序碱基占整个基因组或目标区域的百分比。没有达到给定深度的部分称为盲隙（gap）。通常同时使用覆盖率和深度描述测序结果。覆盖度图采用病原全基因组模式图的形式，展示病原检出位点及检测次数的分布情况。测序深度指测序得到的碱基总量与基因组大小的比值，或可理解为基因组中每个碱基被测序到的平均次数。（4）相对丰度：指除去宿主序列之后，某微生物序列在相应5大类微生物类别中的分布比例。丰度越高，表示该微生物所占比例越高。它只能指示同一样本中某微生物的相对数量，不能用于不同样本之间的比较。(5)Q值：指质量分值，用于衡量测序准确度,公式为Q=-IOIogIOPz其中P代表该碱基被测序错误的概率。如Q20表示该碱基检测错误的概率为1%。(6)RPM:每一百万条测得序列包含的阳性reads数(readspermillion)0(7)RPTM:每一千万条测得序列包含的阳性reads数(readspertenmillion)o五.mNGS报告解读问题9:mNGS检测结果用于LRTI病原学诊断时应遵循何种流程和路径？1 .分析报告质量，判断结果可信程度：根据送检标本类型、报告形式及内容判断检测结果是否规范可信。2 .对mNGS检测出的微生物进行分级：参照附表1判断mNGS检出的微生物为致病性微生物、条件致病微生物还是定植微生物。致病性微生物在肺内定植可能性低，阳性结果多考虑为导致感染的病原。条件致病微生物需结合患者的宿主因素、血液理化指标和影像学特征、抗感染药物用药史及治疗反应、传统微生物学检测结果综合分析进一步判断是否致病。定植微生物引起LRTI的可能性低，多不考虑致病，但吸入性肺炎、肺脓肿、脓胸等混合性感染时，口腔定植微生物也可能致病。经皮穿刺肺活检标本或胸腔积液标本检出的皮肤定植微生物，通常不致病。遇到不熟悉的微生物，可借助病原检索工具https:/WWW.ChinaPneUpathogens查询其在既往感染性病例中的报道。3 .根据临床特征，结合mNGS微生物分级进行临床决策（图1）:如确定为致病病原体（注：此处致病病原体为临床决策后的微生物分级，不同于上文致病性微生物），可根据该结果进行针对性治疗。如判断为可能致病病原体，则需评估患者病情状况：危重症患者，可结合临床特征先根据mNGS结果调整抗感染方案，同时寻求其他支持证据（如临床微生物室涂片/培养结果、抗原/抗体检测结果、PCR检测结果等）综合判断其致病的可能性和进行针对性治疗的必要性；非危重症患者可先寻求其他支持证据，再调整治疗方案。图1mNGS结果临床解读流程4 .mNGS阴性结果的临床决策：若mNGS结果为阴性，但综合临床特征，仍强烈怀疑为感染性疾病，则建议对报告中的背景微生物、原始数据列表或其他病原微生物检测结果进行分析（图1）。若临床特征支持非感染性疾病，应对原发疾病进行诊治。5 .组织多学科会诊（multi-disciplinarytreatment,MDT）:若经过以上流程，仍无法确认致病病原体，可组织MDT讨论。6 .经验总结鉴于mNGS用于诊断LRTI尚缺乏充分的循证医学证据,因此，临床医师在使用每一例报告后应进行回顾性分析总结，积累临床经验。问题10：如何对mNGS检测报告的微生物进行致病概率分级？根据微生物在下呼吸道的致病性特征，初步分为致病性微生物、条件致病微生物和定植微生物（附表1）。条件致病微生物的判断需要结合患者的宿主因素、血液理化指标和影像学特征、抗感染药物用药史及治疗反应、传统微生物学检测结果综合分析。免疫抑制宿主发生机会性感染的风险更高，病原微生物包括肺泡子菌、分枝杆菌属、诺卡菌属、曲霉属、毛霉目、隐球菌属、巨细胞病毒（CMV）、铜绿假单胞菌等【22-24o免疫正常宿主LRTI按照起病场所分为社区起病25271和医院起病128-29o社区起病的LRTI应排查流行病学和特定病原微生物的接触史，如疫区、传染源、禽类、蝙蝠等接触史，应考虑到结核分枝杆菌、禽流感病毒、隐球菌属、组织胞浆菌属等病原微生物。较长时间的抗感染治疗会影响病原微生物检出3。凌,经验性治疗失败后应尽快完善检查并需要考虑未能有效覆盖的病原微生物。常用于辅助LRTl判断推测感染病原体的理化项目包括：血常规及外周血细胞分类、降钙素原(procalcitonin,PCT)、C反应蛋白(Creactiveprotein,CRP)、红细胞沉降率(erythrocytesedimentationrate,ESR)等，部分特殊感染还可能影响肝肾功能、凝血功能；其他理化指标如肿瘤标志物、自身抗体谱、免疫球蛋白、补体等常用于与非感染性疾病的鉴别诊断。胸部影像学改变方面，大多数病原微生物都可导致肺实变，如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、军团菌、腺病毒等133-34。肺部结节伴空洞形成常由真菌导致，如曲霉属、毛霉目、隐球菌属等；也可以见于金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、放线菌属、诺卡菌属引起的感染。弥漫性磨玻璃样病变主要见于肺泡子菌、肺炎支原体和病毒(如CMV、流感病毒等)35。mNGS检测结果的解读必须结合常规微生物实验室检测，包括但不限于涂片和培养、特殊染色、Y干扰素释放实验、单重/多重PCR或一代测序等分子生物学检测，真菌G试验、GM试验、曲霉IgG抗体、寄生虫血清特异性抗体、隐球菌荚膜多糖抗原，肺炎链球菌、嗜肺军团菌尿抗原检测等。问题11：如何根据mNGS阳性报告作出临床决策？mNGS可能出现阴性结果，即未报告明确病原体。对此应结合临床和常规微生物实验室检测结果，综合判断是真阴性还是假阴性（图1）。真阴性指患者肺内病灶并非是感染性疾病所致，如弥漫性间质性改变可能为结缔组织疾病肺累及或其他弥漫性实质性肺疾病（diffuseparenchymallungdisease,DPLD）假阴性是指未能检出感染致病微生物。通常见于以下情况：（1）技术原因而导致的假阴性，例如部分呼吸道病原微生物外壁很厚或脂质成分高3637,核酸提取过程中难以破壁，致核酸未彻底释放，如曲霉属、毛霉目、隐球菌属和诺卡菌属、分枝杆菌属等38-39；标本储存或者运输问题致样本核酸降解,如流感病毒等RNA病毒易出现该情况；（2）所使用的数据库不全，导致检出病原微生物序列未准确注释；（3）生信分析错误而致漏报致病微生物；（4）标本中人源核酸过高；（5）样本中病原微生物载量低于mNGS最低检测下限,或测序数据量太低未能覆盖到该病原微生物40,例如已接受有效抗微生物药物治疗而导致病原微生物负荷显著降低而难以被检出；（6）采样不规范或标本类型不合适（详见问题13）等。当mNGS回报阴性结果时，临床仍不能排除LRTL临床医生应进一步详尽了解病史、发病特点及诊疗经过及治疗反应，结合影像学特点，反复送检常规病原学检查，必要时可送检不同部位标本（如BALFx血、肺组织等）进行mNGS检查，并动态评估患者对抗感染治疗的反应以协助进一步明确疾病类型。问题12:mNGS报告中出现多种病原微生物如何解读？mNGS检测中出现多种病原微生物时，推荐首先通过显微镜检查、培养、抗原、PCR等方法确认，并结合临床特征解读。必要时可通过不同部位标本mNGS检测结果进行相互印证。mNGS可在一份标本中检测到多种微生物,当出现以下情况时，考虑其中一种或多种微生物为假阳性结果：（1）标本质量不合格；（2）标本采集、送检过程受呼吸道定植菌、皮肤定植菌、环境菌、工程菌的污染；（3）检测过程中背景菌的质量控制不严格；（4）患者的职业和生活环境、基础疾病、临床特点和影像特征与检出的微生物不相符；（5）无法用其他微生物学方法验证；（6）治疗反应和疾病转归与检出的微生物不相符。以下临床场景多支持mNGS检出的多病原微生物为真阳性结果1）误吸风险或明确误吸史的患者，出现多种常见口腔定植菌，需考虑吸入性肺炎/肺脓肿。此类病例常可同时在下呼吸道标本涂片和（或）培养中检出相应的混杂菌群。（2）CAP患者有时会出现细菌、非典型病原体、呼吸道病毒等混合感染41*。（3）免疫缺陷宿主LRTI常发生细菌、真菌、病毒、分枝杆菌等病原微生物的混合感染。问题13:标本类型对解读mNGS报告有什么影响？1 .痰（包括诱导痰）、气管吸引物、BALF及各种经支气管肺活检标本：（1）易受口腔或上呼吸道常见定植微生物的污染，主要包括念珠菌属、链球菌属、葡萄球菌属、奈瑟菌属、厌氧菌等。（2）BALF标本中致病微生物的载量通常较高，受非致病微生物和人源核酸的干扰较小，当疑似感染部位BALF标本的mNGS检测结果为阴性时，虽然不能据此完全排除感染18,但可作为排除感染的重要依据，应结合临床表现、肺部影像表现、抗感染治疗反应及其他病原微生物检测结果重新审视感染的诊断是否正确。（3）经支气管肺活检标本通常组织块较小，有时可能来自于感染周边的反应性炎症区域，致病微生物的载量可能较低，同时人源核酸占比高,检测结果受的干扰较大,所以其阴性结果并不能排除感染口8,38,43。2 .胸腔积液与肺组织标本：（1）经皮穿刺标本易受皮肤定植微生物或环境微生物污染，如表皮葡萄球菌、类白喉杆菌、耻垢杆菌、丙酸杆菌等。（2）经皮肺穿刺活检标本通常组织块较小，有时可能来自于感染周边的反应性炎症区域，致病微生物的载量可能较低，同时人源核酸占比高，检测结果受的干扰较大，因此其阴性结果不能排除感染口8.38,43,但如果mNGS的送检标本为大块的外科手术活检或切除标本，其阴性结果应该可以作为排除感染的重要依据；（3）脓胸中虽然致病微生物的载量较高，但也同时存在大量的炎症细胞，人源核酸占比高，mNGS检测过程中的去人源核酸操作可能导致检测结果呈假阴性。3 .血液：（1）正常人的血液中可能存在皮肤、肠道或上呼吸道定植微生物死亡后崩解产生的微量核酸片段，血液检出致病微生物序列不代表该病原微生物来自呼吸道，也可能来自肠道或者其他部位。（2）血液标本检出CMV、EB病毒等DNA病毒时，只能说明血液中存在病毒核酸，是否存在病毒性肺炎需要结合临床表现、肺部影像表现和下呼吸道标本的检测结果综合判断。（3）血液标本中致病微生物的载量往往较低，而且检测结果受人源核酸的干扰较大，其阴性结果不能排除感染18,38,43。（4）血浆微生物mNGS与其他体液mNGS不同，是无细胞的游离DNA（celI-freeDNA,cfDNA）测序,在去除血细胞的过程中可能导致胞内病原体（如立克次体、衣原体等）被同时去除，因而某些胞内致病微生物感染可能出现假阴性，可考虑对血细胞层进行mNGS检测。问题14:mNGS报告中低reads数微生物如何解读？1 .mNGS报告一些病原微生物的reads数低时，应从以下几个方面加以考虑：（1）某些病原微生物的核酸提取效率低和（或）标本中该病原载量较低；（2）采样、运输和实验过程中引入污染可能，结合临床分析之后,若考虑此低reads微生物不是致病微生物，应考虑污染或者假阳性结果；（3）生信分析中出现假阳性结果。2 .临床医生应结合患者临床表现、影像学、常规微生物学检测结果，综合判断该低reads病原微生物的临床价值。如果怀疑此微生物感染，条件允许时采用另一方法验证。检测出低reads病原微生物无法用临床微生物常规方法进行验证时，可要求检测方提供该微生物原始数据，直接与高质量的参考基因组比对，如果此病原微生物意义重大，条件允许，也可以自行设计PCR引物或一代测序等验证。（1）某些微生物核酸提取效率较低，致其检出reads数少，例如，BALFmNGS测出少量结核分枝杆菌的reads,应关注XPertMTB/RIF是否阳性;BALFmNGS测出少量新型隐球菌的reads,应关注外周血或BALF隐球菌荚膜多糖抗原检测结果;BALFmNGS测出少量曲霉菌的reads,应关注BALFGM和（或）曲霉菌属IgG抗体结果;（2）血浆CfDNA测序对于胞内病原体（如立克次体、衣原体等）测得的reads往往较低；（3）如果血或呼吸道标本mNGS报告低reads数的病毒,应关注PCR检测结果；（4）BALF报告某些易培养的细菌低reads数，应关注BALF细菌培养的结果;（5）血浆mNGS报告一些低reads数微生物时，有可能是其他部位的感染，微生物被抗菌药物、人的免疫细胞裂解后释放出游离核酸，循环入血后被核酸外切酶裂解成小片段的CfDNA,也可能是其他部位定植的微生物，例如造血干细胞移植患者往往肠道屏障受损，可从血浆mNGS中检测出低reads数的部分肠道微生物。3 .对于难以确定临床意义的低序列数微生物,必要时可进行MDT讨论。问题15:根据mNGS报告结果，何种情况下应该考虑追踪mNGS检测的原始数据列表？mNGS检测结果报告还存在一定的漏报比例，尤其是胞内感染或破壁困难的病原微生物、临床少见的病原微生物。检测报告发现的这些病原微生物信号偏低，且和阴性对照检出的序列数相当时，实验室可能会考虑不报告。因此，如果临床上根据患者的病史、影像学和常规实验室检查仍然高度怀疑感染性疾病，质疑mNGS报告给出的检测结果时，可以考虑向检测实验室追踪检测结果的原始数据列表，结合临床资料在其中查找可能的病原微生物。问题16:LR11病原诊断中耐药基因毒力基因意义如何？mNGS可提供耐药基因与毒力基因，但受限于序列读长和测序深度，尚有一定局限性：（1）对于如水解酶等耐药机制，难以获得基因全长序列，不能深入分析耐药基因亚型。（2）基因点突变是病毒（如CMV、流感病毒等）和结核分枝杆菌等常见的耐药机制，需要足够的测序深度和精准度，才能检出相关基因突变，预测耐药信息。（3）mNGS结果易受标本类型及质量等因素影响。检出多种微生物时，耐药与毒力基因难以精准匹配到具体微生物。（4）难以确定耐药或毒力基因型与其表型的一致性，即mNGS检测获得的基因信息只能定性地提示致病微生物可能具有某一种耐药机制,但无法确定该耐药基因是否表达,也无法得出药敏表型。（5）耐药基因与毒力基因仅占病原微生物全基因组的一小部分，检测敏感度有限，假阴性率高。因此，应谨慎解读mNGS中耐药基因和毒力基因的检测结果。六.多学科会诊（MDT）问题17:如何结合mNGS报告组织疑难LRTlMDT?1.针对疑难LRTI病例的会诊，建议由医务部门或相关科室，组织呼吸与危重症、感染、临床微生物、临床药学等专业人员共同参与【44】。必要时可以扩大会诊参与范围，如特殊部位考虑对应专科，特殊年龄考虑儿科、老年病、感染控制等专科，特殊情况考虑病理、影像等，必要时邀请熟悉mNGS试验流程的生信和技术人员参加。会诊应立足临床信息，并围绕mNGS报告及其他微生物检验结果进行解释,对相应感染进行判断，对进一步处置和感染控制给出建议。2.如mNGS报告检出具有公共卫生安全隐患或国家法定传染病的病原微生物时，应严格按照国家传染病法规和院内传染病防控管理要求，对患者及接触患者的会诊人员、患者标本综合处置，严格执行隔离与上报制度。七.展望与常规下呼吸道病原微生物检测方法相比,mNGS的规范应用可高效、准确、全面地识别病原微生物，有助于感染性疾病的早期诊断，也可以对病原微生物进行快速流行病学分析，确定潜在的传播链45。但是,mNGS技术上存在局限性，如假阳性率高、部分胞内菌或厚壁微生物检出率低；在LRTI临床应用方面尚无统一标准,循证医学证据不足117,461。由于这些问题的存在,当前mNGS可作为LRTI常规临床微生物检测技术的补充。本共识的重要意义在于，通过确定标准规范的样本采集、数据分析和临床解读流程，促进mNGS合理用于LRTI临床实践，同时指导开展临床研究获得一批高质量的循证医学证据，为下一版共识提供更多的依据。通过mNGS临床应用经验的不断积累未来目标是使mNGS检测流程标准化、检测方法同质化、数据解读生物信息库标准化，从而为感染性疾病的诊断提供更加专业的指导。八.场景再现/真实案例（附录1）场景再现是通过病例还原真实场景，使读者更好地理解共识，因为篇幅有限，每个病例的临床资料不能完整呈现,请大家在阅读时重点关注mNGS的临床应用。参考文献(略)附录1场景再现/真实案例场景再现1：mNGS适用的临床场景及标本选择患者男，40岁，因高热、咳嗽、咳痰、咯血、呼吸困难4d诊断肺炎、呼吸衰竭，急诊气管插管有创机械通气治疗后转入RICUo既往因IgA肾病激素及免疫抑制剂治疗2个月。院外给予美罗培南、头抱哌酮/舒巴坦、利奈嘤胺、卡泊芬净、更昔洛韦等治疗效果不佳。入院时生命体征：脉率(HR)107次min,血压(BP)112/69mmHg,呼吸频率(RR)30次min,氧合指数(PaO2FiO2)87mmHgo血白细胞(WBC)11.95×109/L,中性粒细胞比例(NEUT%)98.7%,C反应蛋白(CRP)>370mg/L,降钙素原(PCT)72.89ng/ml,肌酊(Cr)376.1molL,肺CT示双肺弥漫磨玻璃密度渗出影和实变影，纵隔气肿。下一步应如何安排病原学检查？A:送检气管吸取物涂片+细菌/真菌培养+药敏、军团菌尿抗原、非典型病原体和常见呼吸道病毒RTPCR等病原学检测；B:送检BALFmNGSDNA+RNA检测;C:送检BALFmNGSDNA检测，同时送检非典型病原体和呼吸道病毒RTPCR军团菌尿抗原、六胺银染色、真菌抗原+涂片+培养、细菌培养+药敏等病原学检测；D:送检BALFmNGSDNA+RNA检测+军团菌尿抗原、六胺银染色、真菌抗原+涂片+培养、细菌培养+药敏等病原学检测。解析：该患者为免疫抑制宿主，急性起病，进展迅速，病情危重,已经出现I型呼吸衰竭，WBCxCRP及PCT显著升高，提示细菌或真菌感染可能性大，肺CT表现不