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2023原发灶不明肿瘤诊疗进展与展望摘要原发灶不明肿瘤(cancerofunknownprimary,CUP)是一种细胞异质性显著并且具有高度恶性表型的转移性疾病，并且很难通过常规的检查手段被检测出其原发灶。一些新的检测手段，如基因表达谱检测、肿瘤表观遗传学检测、液体活检等手段逐渐应用于CUP原发灶的确定上，基于此出现的器官特异性治疗、靶向治疗、免疫治疗等也均有较大的应用前景，其有望提高CUP患者诊断的精确性和特异性，延长患者生存时间，改善患者生存质量。本文针对CUP的前沿诊断技术和治疗选择及其进展进行综述。、*刖百原发灶不明肿瘤(cancerofunknownprimary,CUP)是一种罕见的恶性肿瘤，其原发部位不能通过常规的诊断方法包括临床常规病史采集、体格检查、常规的影像学检查确定。CUP的典型特征是侵袭性高、早期转移以及不可预测的扩散方式。CUP患者的治疗机会较少，预后不良川。CUP占癌症的比例5%,但是由于其死亡率较高，所以此类疾病在癌症整体死亡率中占比很大。过去几十年CUP发病率的下降可归因于诊断技术的进步，导致定位原发附中瘤的成功率提高2。CUP是具有显著异质性的一组疾病，包含不同的原发肿瘤类型。因为病因和病理学的不确定性，目前针对CUP的诊断和治疗仍然缺乏充足的循证医学的证据，并且尚存争议，但是随着二代测序(next-generationsequencing,NGS)和基因组、转录组分析等技术的出现和进步，对该领域引起了较大关注，本文就针对CUP的诊断治疗及其相关技术的前沿与发展进行综述。01、CUP的诊断1.1 常规检查诊断CUP首先要进行完整详尽的病史采集和体格检查。CUP的临床表现存在异质性。欧洲肿瘤学会临床实践指南建议对患者进行彻底的诊断检查,其中包括常规临床评估、系统的体格检查、血液/生化分析和放射检查2。具体的常规检查项目见表1o氟脱氧葡萄糖-正电子体层扫描(18F-FDGPET/CT)的发展提高了CUP患者的检出率，但是对微小病灶及活性低的病灶不易查出3。虽然血液中各种肿瘤标志物的升高，与其原发肿瘤的类型有一定的关系，但是特异性和敏感度均不是很高2。1.2 病理诊断有研究显示，CUP患者中约50%为中高分化腺癌，约30%为低分化或未分化癌，约15%为鳞状细胞癌，约5%为未分化肿瘤2。另有研究提示,部分致癌基因的表达在转移细胞中，可用于追溯起源组织，这种特点在高分化癌症中更为常见，而在低分化或未分化的癌症很少保留这种特点4。因此，免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)检测在转移灶评估中发挥重要作用，如表2所示。由于取到的活检组织过小”艮制了病理诊断的敏感度和特异性。这种情况下，病理专家的经验在诊断中发挥关键作用，所以该方法主要限制之一也是缺乏客观的评估标准，并且因此可能分类不明，尤其是部分的低分化肿瘤，不同的低分化肿瘤可以有着相同的表达标记，对确定单一的原发部位具有挑战性4。13基因表达谱分析技术基因表达谱分析技术(geneexpressionprofile,GEP)可以综合分析该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度。GEP可以提取基因特征和表达分子作为判断原发灶的特异指征。一系列常见和罕见肿瘤类型的基因组、转录组和表观遗传分析正在开展中。1.3.1 非编码RNA非编码RNA是指不编码蛋白质的RNAo其中包括核糖体RNA(rRNA微RNA(miRNA)等多种已知功能的RNA。miRNA分析是比较成熟的验证CUP起源的一种技术，Pentheroudakis等5将CUP转移灶的miRNA谱与已知原发灶的原发组织匹配的转移灶的miRNA谱进行比较的研究，但是尚未发现实质性差异，并且该研究的局限性是所有研究的CUP病例均属于CUP治疗的有利亚组所以会有一些基因信息上的偏倚。1.aprovitera等6使用液滴数字PCR技术检测miRNA表达谱对CUP患者进行分子诊断并且评估患者预后，表明这项技术可以辅助进行临床决策。编码RNA1.u等7设计出一种基于基因微阵列技术的机器学习算法，在TCGA和GEO训练集中预测准确性分别达到96.9%和95.3%,表明该算法不仅可以减少临床诊断的成本，而且具有很高的精确性。然而在这些微阵列的研究中，低分化和未分化的原发性肿瘤准确率较低(尤其是肺癌和胰腺癌)，由于这两个部位是诊断出的CUP中最常见的原发癌症部位，所以微阵列技术检测仍然有很大的局限性网。同时逆转录PCR(reversetranscriptionPCR,RT-PCR)和定量逆转录PCR(quantitativereversetranscriptionPCR,RT-qPCR)被认为是一种更易于使用、快速且成本低的选择。Varadhachary等9使用RT-PCR检查了120例CUP患者中10个特征基因的表达，并评估了61%的患者的可能起源组织,这项研究显示，与含有紫杉烷和粕类的CUP经验性化疗方案相比，具有结肠癌特征的CUP患者对结肠癌特异性方案的反应更好。1.3.2 表观遗传学表观遗传学(epigenetics)包括了DNA甲基化，基因组印记等机制。Moran等10的研究验证了一种方法,其通过DNA甲基化分析进行的表观遗传分析，开发了一种称为EPICUPDNA甲基化分析的分析方法。此方法是通过对2790个已知原发部函中瘤样本分析得出的，用这种方法预测了216名CUP患者,其中87%的患者成功预测出了原发部位。Chen等11提出将基因组图谱和DNA甲基化分析结合的策略，在该研究中基因组图谱和DNA甲基化预测准确率分别为68.8%和100%,并且二者预测起源组织的阳性结果完全一致,这仍然需要更多的临床试验的验证。1.4二代测序技术CUP组织学亚型不同，其突变谱是不同的：腺癌和低分化癌亚型在涉及信号转导通路的基因中表现出突变，而鳞状细胞癌的突变多涉及细胞周期和DNA修复口2o一项针对350例患者的研究，通过组织NGS确定，85%的CUP患者携带1个癌基因驱动突变13,NGS一直使用组织活检标本进行。然而，组织的使用存在局限性，包括难以进行活检。此外，肿瘤内基因异质性和伴随治疗干预可能发生的动态突变使情况进一步复杂化14。所以，组织取样可能并不能全面了解患者疾病进展中存在的分子变化。因此,突变分析的另一种方法是对循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA,CtDNA)的检查。CUP患者的液体活检能够以非侵入性方式揭示药物引起的变化15o在美国临床肿瘤学会(ASCO)2020年年会上口6,公布了迄今最大的CUP患者队列的游离细胞DNA(cellfreeDNA,cfDNA)分析结果。这些数据显示出为CUP患者研究匹配的靶向治疗的可行性，用NGS检查CfDNA在CUP诊断中具有巨大潜力既可以识别起源组织，也可以选择患者进行个性化治疗。Schipper等17基于全基因组测序设计了一种预测算法,在队列中,这种算法正确预测了78%样本的原发灶类型。POSner等18的研究中，DNA谱和RNA谱分析可以诊断出33%的原发部位,并且DNA突变谱分析是信息更为丰富的诊断方法。止匕外，Mohrmann等19研究还报道了大量的致病，性生殖系突变的CUP患者,因此，对于CUP的年轻患者或者既往有恶性肿瘤病史的患者，生殖系检测也是要纳入考虑的。因此，使用NGS进行全面的分子分析正迅速成为包括CUP在内的晚期癌症治疗的重要组成部分。02、CUP的治疗迄今为止，还未有可以作为治疗标准的特定方案。多数CUP患者必须接受经验性化疗，如紫杉烷或粕类方案20。另外，Hasegawa等21也证明了器官特异性治疗的临床应用价值，并可能在治疗决策中帮助患者。然而在Nishikawa等22的研究中，器官特异性治疗组和经验性治疗组的总生存率未显示出统计学差异，所以仍然需要更多的循证医学证据。2.1 分子靶向治疗除了器官特异性治疗外，基于NGS的分子靶向治疗是未来CUP试验设计中应纳入的另一种策略。然而，通过分子谱分析彻底治疗CUP仍为时过早。目前，仅少数靶向药物适用于一线单一治疗，在许多恶性M瘤的治疗中，联合化疗仍然发挥着重要作用23。NGS有助于预测CUP的原发部位并指导治疗，这种针对CUP患者的靶向治疗已进入临床试验阶段24。一项II期试验根据NGS评估了器官特异性和靶向治疗的影响，中位总生存期和无进展生存期分别超过了治疗不利CUP亚群患者的结果24。Ross等13报道了NGS发现的伴有棘皮动物微管结合蛋白样与间变性淋巴瘤激酶融合基因(echinodermmicrotubule-associatedprotein-like4-anaplasticlymphomakinasezEML4-ALK)的CUP病例，患者在ALK抑制剂克嘤替尼靶向治疗后达到部分缓解(Partialresponse,PR)。Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(Kirstenratsarcomaviraloncogene,KRAS)突变是队列研究中的另一个反复出现的特征13,正在进行研究以评估KRASG12C抑制剂与其他药物的组合的疗效25。KRAS作为新颖的治疗靶点出现这可能为诊断为CUP的患者提供了新的靶向治疗选择。2.2 免疫治疗免疫治疗的效果很大程度上取决于肿瘤微环境，然而关于CUP中肿瘤免疫微环境的数据很少。对71例病例的转录组分析证实了CUP中程序性死亡配体-1(programmeddeath-ligand1,PD-L1)的表达与肿瘤浸润淋巴细胞密度的关系，从而揭示了免疫治疗的潜在益处26。高微卫星不稳定性(microsatelliteinstability-highzMSI-HPD-L1表达和高肿瘤突变负荷(tumormutationburden,TMB-H)已被确定为可用于评估免疫疗法疗效的泛癌生物标志物27。MSI-H的CUP患者的发病率在全球范围内都很低，根据分析技术的不同存在一些差异：NGS和IHC为1.6%28rCfDNA分析为2.4%16o止匕外，Benedikt等29比较了头颈部原发灶不明鳞状细胞癌与口咽部鳞状细胞癌中PD-L1的表达,发现原发灶不明鳞状细胞癌中PD-L1的表达显著高于口咽部鳞状细胞癌并且在p16阴性的原发灶不明鳞状细胞癌患者中，PD-L1高表达是一个独立的预后因素。GataIiCa等28研究发现362例患者中有22%出现肿瘤PD-Ll表达,12%出现了TMB-H表达,为CUP患者使用ICIs治疗提供了一种新的选择。其他有关ICIs在CUP中作用的临床试验正在进行中。因此，根据临床特征和生物标志物选择治疗患者至关重要，为目前正在开展的CUP免疫治疗相关临床试验(表3I一项研究探讨了CUP患者对ICIs的反应性和耐药性与其基因组突变的相关性，对ICIs反应的基因组，如细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependentkinase4zCDK4斑点型锌指结构蛋白(speckle-typePOZprotein,SPOP)等和ICIs抵抗的基因组，如磷酸酶张力蛋白同源物基因(phosphataseandtensionhomolog,PTEN2微球蛋白(-2microglobulin,B2M)等在CUP患者中不具有预测预后意义，除了TMB>10个突变/兆碱基的患者在接受ICIs治疗时展现出积极的治疗效果30。Raghav等31研究了帕博利珠单抗对于进展期CUP患者的疗效和安全性,该研究表明帕博利珠单抗的应用有着一定积极的疗效并且安全性可以接受。对于预后不良型的CUP患者，免疫治疗的疗效和预测疗效的生物标志物选择仍然需要更多的循证医学的证据和研究。2.3 人源肿瘤异种移植瘤/类器官等个体化治疗人源肿瘤异种移植瘤(patient-derivedxenograft,PDX)通过将来源于患者的组织移植到免疫缺陷型小鼠体内进而形成肿瘤模型。由于这个模型直接来源于患者，所以在PDX中可以保存组织病理学特点和细胞异质性。Miyake等32首次基于CUP构建了PDX模型，并且在此基础上精准识别出有效的化疗方案，最终探索出优于经验性化疗的治疗选择。后续一些基于罕见癌症类型的PDX显示出了相关的临床价值，比如神经内分泌性前列腺癌33等。上述研究均初步表明了PDX在CUP治疗中的巨大潜力。然而，在小鼠体内成长的肿瘤组织，不可避免地会呈现出肿瘤细胞和小鼠细胞的混合状态。类器官是来源于原代组织或者干细胞等在体外特殊培养形成的能够自我更新并显示器官功能的3D模型，具有稳定的表型和遗传特征，可以真实的模拟肿瘤在体内的各方面特性34。类器官结合基因编辑技术比如CRISPR技术,有助于发现肿瘤的相关生物标志物,发现某种基因在癌症发生和发展中发挥作用，并据此进行靶向治疗研究或者药物研发34。因此,类器官CUP模型的建立和应用也是CUP个体化治疗方案很重要发展方向，具有巨大的应用潜力。03、结语与展望目前，基因表达谱分析、表观遗传学分析、液体活检等新型的诊断方法的出现和技术进步，为识别CUP的原发灶提供了新的方法，这在部分临床试验中得到验证。所以，IHC和这些新的技术和诊断方法应成为互补的诊断工具来提高CUP患者的诊断率。另外，靶向治疗和免疫治疗也在临床试验中得以应用，并且取得了一定的疗效，这可能提示了上述治疗方法在临床治疗中的应用前景，但仍然需要更多的预测性生物标志物为CUP的患者做更为明确且有效的分类，以便为患者提供更为有效且精准的个体化治疗。