2022类固醇生成因子-1基因突变及其相关临床表型研究进展（全文）.docx

2022类固醇生成因子1基因突变及其相关临床表型研究进展(全文)摘要类固醇生成因子(SF-I,NR5Al)是在性腺及肾上腺发育过程中起关键调控作用的转录因子。NR5A1基因突变是性发育异常(disordersofsexdevelopment,DSD)常见病因之一，目前临床报道的病例多为杂合突变。该基因突变患者临床表型复杂，早期报道的患者表现为不同程度的46,XY性腺发育不良，近年发现该基因突变与男性无精症或女性的卵巢早衰有关，多数患者无肾上腺皮质功能不全。目前认为患者临床表型异质性，可能与不同基因突变对转录活性的功能影响、下游靶基因(如SOX9等)基因剂量效应以及寡基因突变等的遗传背景等相关。通过对NR5A1突变的基因型和相关表型开展研究，有助于人们深入理解性腺发育的过程及其调控机制。一、NR5Al分子结构特征类固醇生成因子-1,也称核受体亚家族5中的A组成员I(SterOidogeniCfactor-1/nuclearreceptorsubfamily5groupAmember1,即SFl,NR5AlAd4BP),是一种孤儿核受体。由位于染色体9q33.3上的NR5A1基因所编码，该基因包含7个外显子，其中6个有编码功能。该基因编码的核受体含有461个氨基酸，其蛋白结构是由含有2个锌指结构的DNA结合域(DBD)、A盒(A-box)、柔性较链区、配体结合区(LBD)及两个激活功能域AF-I和AF-2构成1,2。DNA结合域是NR5A1结构中最保守的区域，第一个锌指结构包含P盒(P-box),可特异性识别靶基因的DNA结合位点，A-box在结合过程中起稳定作用，较链区及AF-2参与转录激活3,4。NR5A1在性腺、肾上腺、脾脏、下丘脑腹内侧核及垂体中广泛表达,是肾上腺及性腺发生过程中的关键转录因子，参与调控类固醇激素生成及，性腺发育过程中相关基因的激活1,5,6,刀。二、NR5A1的功能与其主要下游靶基因的调控人胚胎期性腺发育主要包括两个阶段，第一个阶段是双向潜能性腺的出现,人胚胎约第4周，生殖崎内面的体腔上皮细胞增殖隆起，此时原始生殖细胞迁移到该部位，形成双向分化潜能性腺8。第二个阶段是双向潜能性腺分化为睾丸或卵巢的过程，若为XY胚胎，则NR5A1将维持其在双向潜能性腺中的表达，继而在GATA4、WTl等多个转录因子的协同下使SRY基因的表达升高,当SRY表达到临界阈值时,与NR5A1相互协同，作用于位于SOX9(SRY-relatedHMGboxgene)基因上游13kb处的睾丸特异性增强子核心元件(TESCo),上调并维持了S0X9基因的表达,而S0X9的表达对于促进及维持支持细胞(SertoliCeIl5。分化至关重要9,：L(U1,在睾丸支持细胞中，NR5A1的主要的下游靶基因是缪勒管抑制因子(anti-Mullerianhormone,AMH),通过激活AMH基因的表达，促进合成分泌缪勒管抑制因子，后者作用于副中肾管结构(即缪勒管结构，MuIleianduct),使其退化，因而阻止了46,XY胚胎中子宫、输卵管、阴道上1/3结构的发育5,12;而在睾丸间质细胞(Leydigcell,LC)中，NR5A1通过调控类固醇生成酶基因的表达，如类固醇生成急性调节蛋白(steroidogenicacuteregulatoryprotein,StAR)x细胞色素P450类固醇羟化酶类，促进了以睾酮为主的雄激素分泌，从而诱导中肾管(Wolffianduct)分化成精囊、附睾和输精管,促进外生殖器男性化及睾丸的下降13。在胚胎期卵巢的发育过程中，FOXL2(forkheadboxL2)通过直接与NR5A1近端启动子结合抑制其表达，抑制睾丸组织的发育。然而，在出生后成熟卵巢颗粒细胞和卵泡膜细胞中NR5Al表达却表现为增加。在颗粒细胞中,NR5A1通过与F0XL2相互作用，与其下游靶基因AMH启动子区域结合，上调其表达，而AMH对于促进卵泡发育和和维持卵巢储备功能至关重要2,14,15;在卵泡膜细胞中,NR5A1可上调StAR、芳香化酶(P450aromatase,CYP19A1).17-羟化酶/17,20-裂解酶Q7-hydroxylase/17,20-lyaseenzyme,CYPI7A1)基因的表达，促进类固醇激素的合成及卵泡的发育16,17。NR5A1主要以单体形式结合DNA,通过识别靶基因启动子中含PyCAAGGTCA的DNA序列来调控睾丸、卵巢及肾上腺皮质类固醇激素相关基因的转录活性，包括StAK胆固醇侧链裂解酶(P450Cholesterolside-chaincleavage,CYP11A11).30-羟类固醇脱氢酶(3-hydroxysteroiddehydrogenase,HSD3B1)xII-羟化酶(Il-hydroxylase,CYP11B1),CYP17Alx21-羟化酶(21-hydroxylase,CYP21A2)x17B-羟类固醇脱氢酶3(17-hydroxysteroiddehydrogenases3,17-HSD3)xCYP19A1等4,18。2011年,SChimmer等19为了探究NR5A1基因对类固醇生成功能的影响，在Yl小鼠肾上腺皮质肿瘤细胞中，用ShRNA敲减NR5A1的表达,发现MC2R(melanocortin2receptor,ACTHR)的转录水平降低最为显著，而CYPllBLStARsHSD3B1、SCARBl的转录水平分别较野生型降低了30%90%以上，类固醇生成水平也大大降低，而当NR5A1表达恢复后以上靶基因的转录水平和类固醇生成量也出现了逆转。然而,CYP11A1的转录水平并未受到NR5A1敲除的影响，提示了不同靶基因的转录对NR5A1表达的依赖程度不同。三、NR5Al敲除的动物模型研究在动物模型的研究中，Luo等通过靶向破坏编码小鼠SF-I的Ftz-Fl基因,发现Ftz-Fl基因纯合缺失的小鼠在出生后8天内死亡，并且出现肾上腺、性腺缺如，皮质酮分泌不足，而外源性补充肾上腺皮质激素可延长其生存时间，表明SF-I在肾上腺皮质的发育中起重要作用，其纯合突变会导致严重的肾上腺皮质功能不全。然而，杂合突变的小鼠往往仅有性腺发育不良但无肾上腺缺失，提示SF-I可能以剂量依赖的方式影响肾上腺和性腺的发育。有趣的是，Bland等20通过建立NR5A1敲除的杂合小鼠模型，发现虽然在静息状态下杂合子小鼠并无肾上腺功能不全的表现，但相较于野生型小鼠，杂合子小鼠的肾上腺及性腺体积明显缩小，并且在应激诱导下皮质酮合成严重受损，无法维持正常代谢，这可能是由于NR5A1单倍剂量不足干扰了肾上腺发育，从而导致应激反应受损，提示NR5A1的正常基因剂量是获得足够应激反应所必需的。Karpova等21采用酵母人工染色体(yeastartificialchromo-some,YAC)Ko小鼠的基础上建立了转基因(SF-I-/；tg/+)小鼠，发现转基因雄性小鼠睾丸中出现精子发育停滞和隐睾等雄性化不足表现，胚胎期间质细胞发育延迟，而出生后小鼠的成年间质细胞发育被完全阻断，与其功能有关的转硫基酶(SUlfotranSferase,SULTlEl)和血管细胞黏附分子(vascularcelladhesionmolecule1,VCAMl)等基因表达显著降低，提示NR5A1的剂量与功能不足导致的间质细胞发育缺陷与雄性化不全表型相关。此外，Fatchiyah等22采用细菌人工染色体(bacterialartificialChromsomeslBAC)在KO小鼠的基础上采用双启动子和Tet-Off系统建立了转基因小鼠。发现这种转基因的“回补”在胚胎中成功恢复了脾脏的体积。然而,这种转基因的小鼠并没有获得存活的幼鼠，且CYP21A1和3-HSD标记基因在肾上腺原基中均无表达,说明肾上腺发育存在严重缺陷，提示不同的NR5A1的基因剂量，对于不同靶组织的发育，其影响水平有所不同。四、NR5Al的突变功能域分布及剂量效应据报道,目前共发现了238例NR5A1突变，包括188种突变类型，其中90%患者的染色体核型为46zXY;这些突变广泛分布于各功能域，主要以DBD(35%)和LBD(42.3%)功能域为主。NR5A1突变类型多样，包括109种错义突变(58%),45种小片段缺失和插入(24%)导致的10个框内突变和35个移码突变，22种无义突变(12.3%),8个内含子变异(3.3%),4个终止密码突变(<1%)。在所有突变类型中，大多是杂合突变，只有约3%为纯合突变23。FABBRl-SCALLET等23认为NR5A1基因突变的遗传模式既不是典型的常染色体隐性遗传，也不是常染色体显性遗传，而是以剂量依赖的方式起作用。Achermann等24描述了第1例NR5A1基因3号外显子DNA结合域P-box中p.G35E杂合突变导致46,XY完全性性腺发育不良的患者，该患者睾丸严重退化，外生殖器呈完全女性型，且伴有肾上腺功能不全，功能研究证实该突变严重损害了NR5A1下游靶基因CYP11A1的转录活性。随后，该研究团队又报道了1例类似表型的女婴，在NR5A1基因A-box区域中发现p.R92Q纯合突变，而其父母与妹妹均为该突变的杂合子，但却有正常的生殖及肾上腺功能，进一步功能研究发现此种纯合突变体转录活性及DNA结合能力的丧失不及P-box突变严重25。以上的病例研究揭示了NR5A1基因以剂量依赖的方式在人类性腺及肾上腺发育过程中起作用，并且不同位点的突变产生的基因剂量效应有所差异。此后的研究发现，在46,XY部分性腺发育不全和男性化不足但肾上腺功能正常的患者中也存在NR5A1杂合突变，这些突变形式包括无义突变、移码突变和错义突变等，常见的表型为轻度性腺发育不良、外生殖器男性化不足而无肾上腺功能不全13,26,27。这些数据都表明了大多数人类NR5A1突变仅影响性腺发育而很少累及肾上腺，似乎相比于肾上腺,性腺发育对NR5A1基因剂量的敏感性更高28。五、NR5Al缺陷相关的临床表型在染色体核型为46,XY个体中,与NR5A1突变相关的临床表型谱很广，从完全性性腺发育不良到外生殖器不同程度男性化(小阴茎、隐睾、尿道下裂等)以及男性不育而无外生殖器发育异常1。在染色体核型为46.XX个体中，NR5A1突变与46,XX睾丸型/卵睾丸型DSD(46,XXtesticularDSD/ovotesticularDSD,TDSD/OTDSD)和原发性卵巢功能不全(primaryovarianinsufficiency,Pol)相关。而无论是在46,XY还是46,XX个体中，肾上腺功能不全(adrenalinsufficiency)均有报道29。1.肾上腺功能不全：根据目前的报道，在人类发育中NR5A1突变引起严重肾上腺功能不全的仅有6例，其突变位点包括p.G35E、p.G35D和p.R255L的杂合突变，p.Glu7*和p.T296M复合杂合突变以及2例p.R92Q纯合突变，分布在NR5A1分子的各个功能域。其中，p.Glu7*和p.T296M复合杂合突变的患者伴有46,XY部分型性腺发育不良,p.G35Rp.R92Q.p.G35D这3例突变的患者伴有46,XY完全性性腺发育不良，而另外2例46,XX的患者仅有孤立的肾上腺功能不全23,30,31。上述突变使类固醇激素合成受阻最终导致肾上腺功能不全，患者均在出生后出现不同程度生长发育迟缓，体重降低、频繁呕吐，皮肤色素沉着等，实验室检查显示血钾升高、血钠降氐、ACTH及肾素活性升高、血浆或尿液中皮质醇、醛固酮含量降低；而单纯糖皮质激素或盐皮质激素不足少见，在使用氢化可的松和氟可的松激素替代治疗后有明显好转25,31,32,33,34。在中国广州单中心的回顾性研究中发现，非先天性肾上腺增生症导致的肾上腺皮质功能不全患者仅占11.3%;这49例患者中先天性肾上腺脑白质营养不良20例，自身免疫性多腺综合征(autoimmunepolyendocrinopathysyndrome,APS)3例；而NR5A1基因突变的患者仅为1例，说明该基因突变不是肾上腺皮质功能减退的主要病因35o2.46,XY性腺发育不良(46,XYgonadaldysplasia,46,XYGD):46,XY性腺发育不良是NR5A1突变最常见的临床表型，可分为完全性与部分性，患者临床表现多样，完全性性腺发育不良的患者常在出生时表现为女性外生殖器，而误作为女孩抚养，往往因青春期出现原发性闭经或乳房发育不良等就诊，少部分患者会出现青春期后的男性化表现。部分性46,XY性腺发育不良的患者常由于睾丸分化及雄激素合成分泌受损而导致出生时外生殖器不明确，性别难辨，可有阴蒂肥大、小阴茎，不同程度尿道下裂及隐睾等表现。根据睾丸退化程度不同以及发生退化的时间段不同，部分患者存在子宫、输卵管等副中肾管结构,也有些患者表现为缺如。此外，患者的睾酮水平也有很大差异，有些患者睾酮水平很低，有些患者睾酮水平接近于正常值或hCG兴奋良好,提示睾丸间质细胞发育程度不同5,36。近几年来，NR5A1新的突变位点陆续被发现。本研究团队在中国人群中报道了10例NR5A1杂合突变导致46,XYGD的患者,包括错义突变、移码突变和无义突变等其中9个为新发现突变类型。患者表现为小阴茎、尿道下裂、隐睾和阴囊对裂等。有2例患者，是由于NR5A1移码突变p.E148fsX295和p.R89fs×105导致，双荧光素酶报告基因系统也证实该两种突变体产生的截短蛋白表达量显著下降，对下游靶基因(CYPIlAI和CYP19A1)的转录活性下降。部分患者可能存在一定程度的青春期男性化,且睾酮水平或hCG兴奋后睾酮水平可以达到正常范围，但睾丸发育差，生精功能低下提示NR5A1基因突变对Sertoli细胞的发育和功能影响较大。此外,在这10例患者当中，有8例至少伴有1个其他与性发育异常有关的基因突变，提示寡基因突变可能是参与患者临床表型异质性的重要原因3刀。2020年,Pan等38报道了1例由于NR5A1移码突变C630delG(p.Y211Tfs*85)导致的46,XYDSD患者,无肾上腺皮质功能减退，hCG兴奋实验睾酮可以较基础升高3倍，说明NR5A1突变对于成熟Leydig细胞雄激素分泌功能影响相对较小，而性发育异常的表型可能源于胎儿Leydig细胞功能缺陷。3 .无精症(azoospermia):Bashamboo等报道了从315例无精症的患者中发现7例患者存在NR5A1蛋白较链区/近端LBD区的杂合错义突变，突变频率约为4%,这7例男性均有严重的生精障碍但无DSD表型及肾上腺功能不全,是该基因突变较为轻微的一种临床表型。2015年，有研究者分析了90名无精子症不育男性与112名可生育男性的NR5A1编码序列，发现90例中有2例(2.2%)出现NR5A1杂合突变，这2例患者突变分布在较链区(p.P97T)和配体结合区(p.E237K),突变频率约2.2%这与之前BaShamb。等39的报道类似。4 .46,XX原发性卵巢功能不全(46,XXprimaryovarianinsufficiency,POI):原发性卵巢功能不全又称为卵巢早衰，是一种以40岁以前卵巢功能衰减为特征的疾病。这类患者可表现为原发性或继发性闭经，月经紊乱、不孕和过早绝经激素水平表现为卵泡刺激素(follicle-stimulatinghormone,FSH)升高、雌二醇(estradiol,E2)水平降低40,41,42。LoUrenCO等41在4个46,XX原发性卵巢功能不全家系成员和25例散发性卵巢功能不全的2例患者中发现了NR5A1的突变，其中突变类型包括杂合错义及移码突变，且功能研究表明这些突变严重损害了NR5A1的转录活性，证实了NR5A1突变与人类卵巢功能不全相关。NR5Al在成熟卵巢组织中持续表达，调节卵巢类固醇激素分泌和卵泡生长成熟所需的基因，这些基因所编码的任何蛋白质的失调都可能导致卵巢功能障碍，如NR5A1突变蛋白可通过降低对CYP19A1基因的反式激活，损害芳香化酶的活性，从而减少E2的合成;并且NR5A1还可通过调控AMH基因的表达来影响卵泡生长发育43。近年，Voican等44发现POI的患者中NR5A1突变只能够解释1.6%的病因，说明该基因突变并非卵巢早衰的主要病因。5 .46,XX睾丸型/卵睾丸型DSD(46,XXtesticularDSD/ovotesticularDSD,TDSD/OTDSD):由于胚胎期卵巢中NR5A1表达水平较低，以往认为它在卵巢发育过程中的作用较小；且46,XX胚胎由于缺乏Y染色体的SRY基因，在WNT4、RSPOl和-catenin等抗睾丸因子的作用下促进原始性腺向卵巢方向发育12。2016年Bashamboo等28,45在4个无关的46,XX睾丸/卵睾性DSD患者中发现NR5A1的杂合错义突变p.R92W(c.274C>该研究提示NR5A1的特定突变可以导致在46,XX胚胎中，未发育成熟卵巢向睾丸的方向转换，这可能是由于NR5A1抑制了-catenin介导的WNT信号转导,从而使DAXl表达降低,减少了对睾丸通路的抑制。46,XXTDSD/OTDSD的患者临床表现也十分复杂，可表现为外生殖器偏向女性仅有阴唇融合或阴蒂肥大，有发育不全的子宫及陶道，也有表现为外生殖器男性化不足，如小阴茎、尿道下裂等，但此类患者多有睾丸组织发育不良，睾丸体积偏小,基础睾酮水平不足,甚至一侧或双侧性腺表现为卵睾，严重的可有睾丸功能衰竭，睾酮及AMH水平极低，hCG兴奋后睾酮水平仍较低，FSH、LH水平升高、生精障碍等46。由于这类患者表型差异大，性腺的发育可兼有卵巢和睾丸结构，其中是否存在寡基因突变的影响，或是否合并影响S0X9增强子的拷贝数变异，尚需要深入研究。6 .脾脏发育异常：NR5A1不仅在肾上腺、性腺等组织中表达，也是脾脏发育过程中的关键调控因子。Zange等报道了一个新的NR5Alp.R103Q纯合突变，该患者表现为46,XY性反转和无脾症，但无肾上腺功能不全，推测可能是由于R1O3Q突变降低了TLXl的反式激活所致，TLXl是一种转录因子,已被证明对小鼠脾脏发育至关重要。此外，R1O3Q突变破坏了类固醇激素合成基因(CYPl7A1)的激活，而不影响NR5A和SRY对SOX9的协同激活。这例患者9个月时由于脾功能低下，出现了败血症。随后，另一研究小组又报道了1例出生表型为女性的46zXYGD患者,伴有多个脾脏,DNA测序发现此患者携带NR5Al基因LBD区杂合无义突变p.Tyr409*,遗传自患有尿道下裂伴有无脾症的父亲。然而,由于报道病例有限,NR5A1突变导致脾脏发育异常(无脾症或多脾)的机制有待进一步阐明47。六、小结NR5A1在人类肾上腺、性腺、下丘脑、垂体和脾脏中广泛表达，是胚胎期性腺及肾上腺发育过程中多种基因的重要调控因子，并且与类固醇激素合成相关基因表达密切，其突变会导致不同类型的DSD伴或不伴肾上腺功能不全，卵巢早衰、无精症以及脾脏发育异常等。目前的研究表明NR5A1下游靶基因众多，以剂量依赖的方式影响临床表型谱，但与其基因型之间关系仍有待进一步探索。