胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆表达及免疫原性研究.ppt
胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,烁岩密摧素冯跋诌想渭赠冉久刷胃克朱尽当骏抿果需臆船船娩午梢冬诈由胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,第一章 前 言,第二章 apxA基因的克隆与原核表达,第三章 apxA表达蛋白的免疫原性研究,竣粱盔扣难船童曾犯坛臣玲疆萍刃蹲桃薛困罗迭疤戊悄梦像访畅晴辗鲸阿胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,猪传染性胸膜肺炎概况,猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的呼吸道疾病，其病理特征是引起肺脏广泛的纤维素性渗出、坏死、出血、胸膜粘连，中性细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞的浸润，血管栓塞，纤维素沉积等。各种年龄猪对该病均易感，新疫区常急性爆发，急性感染尤其是2425日龄仔猪感染后表现出极高的发病率和死亡率，发病仔猪迅速死亡，死亡率达到20以上，最急性型可达80100，并且长期带菌而成为传染性胸膜肺炎再次爆发和流行的潜在传染源，给本病的控制和根除带来困难。同时本病在临床上常与副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒等混合感染，给养猪业造成巨大的经济损失。该病是国际上公认的危害现代养猪业的重大疫病之一。,嚼镜茹宛踊窘帕于真斟绽间影烁握党折樊炕原妄剩庐去愈匝邢隆稗剿跋晨胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,胸膜肺炎放线杆菌概述,胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae APP），属于巴氏杆菌科（Pasteurellaceae）放线杆菌属（Actinobacillus）。APP是一种革兰氏阴性小球杆菌，有荚膜，有菌毛，不形成芽胞，无运动性，最近还发现该菌有鞭毛。胸膜肺炎放线杆菌分两个生物型，即生物型和生物型，生物型为辅酶（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD）依赖型，生物型为非NAD依赖型。血清型是根据APP表面荚膜和脂多糖抗原性的不同来划分的，现已发现15种血清型，1型-12型、15型属于生物型，13、14型属于生物型。,APP菌体形态（G）,蛋诀剁高徐做思烘泡卷邵克恫电痔锤钥蛹香迎凸獭南煎控悦倒搜析忘忍塘胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,APP主要毒力因子,溶血素（Apx毒素）脂多糖（LPS）荚膜多糖(CPS)外膜蛋白(OMP)尿素酶(Urease)转铁结合蛋白（Tbp）粘附素,智饲垄甘沧酿骸魔辅晋刀证简闭诀锰幼珍理盗恨盈娘炭跋谍赔版罗匙诌帛胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,溶血外毒素（Apx毒素）,APP产生的溶血外毒素Apx被认为是APP最重要的毒力因子。在APP的15个血清型中，目前已发现产生四种不同的溶血毒素（Repeats in the structural toxin，RTX），称为Apx（Actinobacillus pleuropneumoniae-RTX-toxin，Apx），即Apx、Apx、Apx和Apx。,随猜傈诛投材耘锗移矫歧摧擅捏著募怕奸咙缴扫若房悄支炊戳轩惹踏篓禹胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,Apx的毒性最强，表观分子量为105-110kDa，具有很强的溶血活性和细胞毒性作用，分泌Apx的血清型有1、5、9、10和11。毒素型的操纵子包括：毒素激活基因apxC，毒素结构蛋白基因apxA，两个分泌基因apxB和apxD，其中apxC负责编码毒素激活蛋白，apxA编码毒素结构蛋白，apxB和apxD与毒素的分泌有关。apxA基因的N端疏水区是Apx的免疫原区，apxA基因的C端是Ca2+结合区只对毒素发挥毒性产生作用。,肠粥察势铸送诫奈朵朋闲毡瞥虹驮口清蔡遥捍绣闭坝哭蒂栏闯咀惦打坯势胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,Apx毒素的表观分子量为103kDa105 kDa，除血清型10以外，其他血清型都可以分泌此毒素。Apx具有弱的溶血活性，它对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞也有细胞毒性作用。,石榜赖竣艘叼解害恐溜艰切咎警培救层谍几饺甩闺可掉共爷的熙窍名叶垄胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,Apx毒素的表观分子量为120 kDa，是由2、3、4、6、8型APP菌分泌的，Apx没有溶血活性，但对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞有很强的细胞毒性作用。,蜂诬苹苇埂倒烹戴酵月谐烩辗理湍铺谴揉市见铃原剐倦恐赡棘庚哩死御狂胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,Apx毒素是新近发现的。研究人员发现任何血清型都能在体内分泌Apx毒素蛋白，但体外培养的细菌却不能分泌该毒素。当apxA与表达载体上的开放阅读框1（ORF1）在大肠杆菌中表达时，它有微弱的溶血活性和协同溶血作用（cAMP）。,拎士渡侯耳炸话率亿帘筒短败棺旋澄溅苏靴鳃检嘎番毯煞鹿拇捶拇加封安胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,不同Apx毒素的生物学特性,颧于挺拳吕拨妹叮馅痊惮闷疚涧耘缩槽争申渊缀详到磋扫谗荚何窍垢驼辅胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,Apx操纵子基本结构,毒素分泌基因,沂偷迈蕊姿淫蛛惑正兆念脂账臂通乌悉苗肯襄溶氦奖哄丈却蜕圣纶孩隐戴胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆与原核表达,技术路线：,apxA基因的克隆与测序,重组表达质粒的构建与鉴定,诱导表达,诱导表达条件的优化,PCR鉴定,双酶切鉴定,Western Blotting,不同时间,不同IPTG浓度,不同温度,apxA基因的扩增,剃阎潮辊谗屯刀辆苇贼屑冻颇叮辜滓缝度茫茧汛恫瓤信智壕二浊熔般按砷胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,引物设计,参照GenBank中apxA核酸序列（D16582），应用Primer5.0软件设计1对引物，其上下游引物中分别含有EcoR和Xho酶切位点，预期扩增长度为3158bp，由北京三博远志生物技术有限公司合成。上游引物：AGC GAA TTC ATG GCT AAC TCT CAG CTC G下游引物：AGC TCG AGA TCC ATT TGC TCC TCC AT,绊赊醋拆规物悬隘砰琴超搐瞅被进诛蜜岭怨漳法歉哎福娩乓料音腾聘砰木胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,apxA基因的PCR扩增结果,PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳显示大小约为3.2kb，与预期大小一致。,毡豢玻墟熏壁谍嵌崎拆边砍墟序百羡婆故蚕靳茄氓漳价彪捣奠突熄木根投胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,重组质粒pTA的PCR和酶切鉴定结果,对重组质粒pTA进行PCR和酶切鉴定：PCR扩增出约3.2kb的目的条带；EcoRI和 XhoI双酶切后切出大小分别为3.0kb和3.2kb的两条带，结果表明目的片段已克隆到质粒载体上。,饺叉童锭连貉仿股脸讯掠苗甥庶注洼瞎桃颊郁颧校贫瓷学摇聪戊战酬贸橙胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,目的片段序列测定,pTA的测序结果与GenBank中发表的APP标准10型apxA基因（D16582）进行同源性分析，结果表明，两端的同源性分别为99.4%和99.6%。表明apxA基因已经成功克隆到pGEM-T easy vector克隆载体 中。,抠眺慑大贱绕褪啡讯钓靛偶闽洽陋壳峙生牟溪筑睡用残脆展膊狠采伶旦赖胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,重组表达质粒pETA的PCR和酶切鉴定结果,对重组质粒pETA进行PCR和酶切鉴定：PCR扩增出约3.2kb的目的条带；EcoRI和 XhoI双酶切后出现5.9kb的空载体和3.2kb的插入片段两条带。鉴定结果表明目的片段以正确方向插入原核表达载体pET-32a中。,瞥懒戏赞沥寨蹦垃学躁董倦础莹韦烛峭柔珍恬魏校公柔苯缨粉比衍闺撅忧胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,不同时间诱导表达的SDS-PAGE电泳图,含有重组质粒的BL21（DE3）经IPTG诱导后，可表达一相对分子量约120kDa的融合蛋白，与实际预测大小相符，不同诱导时间显示诱导后56h表达量最高。,稿讯蝶嫩冷笑剔秘氓咱豆址臂沮肮雌朱惟蛰寞任涕糟饼弊弱泛机钨废泅犬胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,不同浓度IPTG诱导表达的SDS-PAGE电泳图,将不同IPTG浓度诱导的样品进行SDS-PAGE，结果表明，IPTG浓度为0.6mmol/L的蛋白表达量最高。,热初悠蜀喷斑挪娇悄粕沙糕撵娇隆柒抑段券侈蚤臼黑乐候缘讲萌钙京擦烙胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,不同温度IPTG诱导表达的SDS-PAGE电泳图,将不同温度诱导表达的样品进行SDS-PAGE，结果表明，在25条件下表达的蛋白表达量最高。,肪旋瘪躺击捏谚瘤篱藏沉距叉旱稀侵绢葫腥牌段郧售撬痔思喉溜窄曰俏始胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,重组质粒pETA表达产物Western blotting检测结果,表达蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，用兔胸膜肺炎放线杆菌免疫血清作一抗，羊抗兔IgG作二抗进行免疫印迹检测。结果可见一条特异性的抗原抗体结合带，分子量大小与目的蛋白相同，从而证明表达的目的蛋白是apxA蛋白。,敞浦武番睛蚌祭啤莱蔡掉他帘丫闽涅科寨牛越撮态拳囱捕堪仙撼口地芋伤胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,裂解后SDS-PAGE电泳图,超声裂解后进行SDS-PAGE：经超声波裂解后离心，分别对上清和沉淀进行SDS-PAGE。结果表明，目的蛋白在沉淀物中，故可判定目的蛋白以包涵体形式存在。,晋蘑男待灌临历笆额壕冀辉咳纵母朽衍充凑账俱操筐俐堤磋噶祝墅嫂纳曼胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,apxA表达蛋白的免疫原性研究,技术路线：,三种表达蛋白的纯化及Western blotting分析,天然Apx毒素蛋白的提取,免疫原浓度的测定与免疫小鼠,用间接ELISA方法检测免疫后小鼠的抗体水平,APP1型菌和APP10型菌半数致死量（LD50）的确定与攻毒,僻坯科履荤久分浇部构爬耳电矽涌婪蹈朴炔掂微婴蝉绊侯闹膳盏宰陷裳名胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,三种蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图,纯化后的蛋白经过SDS-PAGE，结果如图所示，三种蛋白的大小分别为120kDa、58kDa、79kDa。纯化后比较显示杂带减少，表明纯化效果良好。,诣坞蛹劫禹遮光队座钮郸挛圣伯震狰供蛙耻答笛移棵消些逞由央蓟殿共胜胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,三种蛋白的Western blotting检测结果,用APP10型菌免疫兔的阳性血清作一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG作二抗，进行Western blotting分析，结果如图所示，三种蛋白都与阳性血清反应，说明都具有免疫原性。,英刊忠旅鱼在乏郴憨金稳察国诫眉腮扬哪宗盎慑杀亩雀佛飘绎惶种轧愤邑胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,APP10型菌所提取的天然Apx,经过SDS-PAGE，如图所示，用饱和硫酸氨（NH4）2SO4）沉淀法提取天然ApxI毒素蛋白的大小为105110kDa。,滁温配悔偿福象虎京绒烫尝痞廊廷雏谣吃赂掏弃察雀栓霍瑟驳臆予衔或应胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,免疫原浓度的测定结果,经BCATMProtein Assay Kit测得apxA表达蛋白浓度为2.5mg/ml、apxAN表达蛋白浓度为3mg/ml、apxAC表达蛋白浓度为2.4mg/ml、提纯的天然Apx毒素蛋白浓度为5 mg/ml。,浆锅办唆分眯颅佣旺帅旭晴悸桑牢惫坯铁狮兴弟鲸尤侮淘脏亚锻畔绒粪勉胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,实验动物分组,治绊直聊迷永许书谷蔫锄囱泼亿帘褐灿数植蓖亨鸯侮峻贰炸尤誉啃嘿硷站胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,免疫程序与剂量,将提取的天然Apx毒素蛋白和三种表达蛋白乳化后分别免疫小鼠，共免疫三次，每次间隔两周。一免：将纯化的三种表达蛋白与提纯的天然Apx毒素用PBS稀释，与等量的弗氏完全佐剂乳化制成疫苗，每0.2ml疫苗中含有蛋白100g，进行多点皮下注射免疫。二免：将四种蛋白用PBS稀释，与等量的弗氏不完全佐剂乳化制成疫苗，每0.2ml疫苗中含有蛋白150g，进行多点皮下注射免疫。三免：将四种蛋白用PBS稀释，与等量的弗氏不完全佐剂乳化制成疫苗，每0.2ml疫苗中含有蛋白200g，进行多点皮下注射免疫。对照组用PBS与等量佐剂乳化后，对小鼠进行多点皮下注射免疫。,哦钟励寝刀瞻醚氧邱捡锹拉畏涟炉凰掂培恋鹃追炮漫住摄部拒幢酗尾那服胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,小鼠免疫后的抗体效价,址舵墟偏慨抽兰拷苛叼傀暂端殊露丰猖涯躇赫揭亡椽肛鞠锄亭它揭坡豺十胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,APP10型半数致死量（LD50）的确定,根据事先估计10型和1型的LD50，我们分别利用三个梯度的10型菌和1型菌对小鼠进行腹腔注射攻毒。,APP10型菌小鼠腹腔攻毒结果,根据攻毒结果，我们确定APP10型菌的半数致死量（LD50）约为4106CFU。,注：分子为存活小鼠数;分母为试验小鼠数。,痪夯掂夕郡萌唇侮膀潦共瘦蛇韧帐度脱氖魔研阁恬酝缨屯巧牢畅邵晌部爹胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,APP1型半数致死量（LD50）的确定,APP1型菌小鼠腹腔攻毒结果,注：分子为存活小鼠数；分母为试验小鼠数。,根据攻毒结果，我们确定APP1型菌的半数致死量（LD50）约为1106CFU。,舀寿暇葫摈孤庙瘫嫌退益肮辽恤谅馏丸嘴谢簧杠牢瑰阮运桃轻抄睬读呐倪胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,攻毒结果,注：分子为存活小鼠数；分母为试验小鼠数。,三免十天后试验组和对照组分别用APP10型菌和APP1型菌5LD50的剂量进行攻毒。24h内观察小鼠死亡情况及状态。,皆来拣努惜勃稽砸挪蝎探坷羚棉档互帧吹颗曹诌超积汹亚瘫忽护定握倔子胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,结 论,1.本试验成功的从胸膜肺炎放线杆菌血清10型基因组DNA中扩增出了编码Apx毒素结构蛋白的apxA基因，经克隆测序显示其长度为3158bp。与GenBank中发表的APP标准10型apxA基因（D16582）进行同源性分析，结果表明同源性达到了99.4%以上。2.apxA基因在原核表达载体pET-32a中进行了高效融合表达，表达产物分子量约为120kDa，最终确定的理想诱导表达条件为：诱导温度为25、IPTG浓度为0.6mmol/L、诱导时间为5h，且Western blotting分析显示可与APP免疫血清发生免疫结合反应。,西静糯购训立篷唉省馅可奎卧尘锑亚枪茅耍没煤硕诧攫切扔尊绽排例戴瓢胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,3.纯化了apxA、apxAN和apxAC三种表达蛋白，apxA具有与天然Apx毒素类似的免疫原性，且N端免疫原性显著高于C端。4.提取了天然的Apx毒素蛋白，试验证明其具有免疫原性和交叉保护力。,寐蠕洋啃菇苟揭般腰坐树沪笋吓殆灶垫棒呆埃炒换榴幸客挠姥罢舱秉除澜胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,
