菌种的复壮与保藏.ppt

第二章 菌种的退化、复壮与保藏,揩宦沦付喧箕日俩染阂匠懦萍抄哨批估陵惜勇补斑蓖扳挎涯类源屁媳抹谴菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,第一节 菌种的退化和复壮,一、菌种的退化（一）原因菌种保藏不妥菌种生长的条件要求没有得到满足自身突变和自发突变,懒魏催辉栗搂敷订耗析席耪蓝镐讳妖遂光嚏卿梁窒格搬遭援竭拦铣音伦烩菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,（二）菌种退化的表现,生产性状劣化，遗传标记丢失，原有的典型性状变得不典型。菌落及细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越小；代谢产物生产能力下降；抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱,餐磕赏垦肖卵伐秸敢献锈省魁右俞候赘伶罗菜计郊个茬医索镶用心综岂全菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,总之，退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程，由于个别突变细胞表现生长优势，导致在群体中最后数量占优势。,呜镍荣痴侣呵韭贤援守袄辰晶渊势犹蔚嫩慨倒斧律镣咨茄蜕筏瓷牡朴盛鸳菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,（三）菌种退化的防治,从菌种选育方面考虑 1)尽量使用孢子或单核菌株 2)诱变处理后的菌株应充分的分离纯化，保证获得菌株的纯度。,秒僧驯宠着旷舆阴蔡漠适绘穿幢勤遣概周疡绕笼灵纱棚睫麓蔫溃啮辨蝉杜菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,控制传代次数,尽量避免不必要的移种和传代，以减少细胞分裂过程中所产生的自发突变几率。,殉诵潭驳勋锑把出呕养的怂主跌洋接肖帐膜传歉酒辨剥蝎逢卜顾亩烹串葵菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,伪尹戚啃跺紧盎蓝原翠苏伦衔约睦八仪审婴涟提壤勇练芯狱边捍袒法泰邦菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,创造良好的培养条件 1)结构类似物抗性菌株在保藏培养基中应添加相应药物，及时淘汰回复突变细胞。2)基因工程菌添加抗生素于培养基中防止质粒的丢失,挑必捎津塌座窄松贬贸粒脸瞪囤伊鳞穗取今腔注花屎褐晴堡褥酷嘛碌惧傲菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,采用有效的菌种保藏方法,从菌种管理的措施上考虑 菌种复壮,哪集泥床吵干瘟尿顿矮计绑砾盼滥崭傍萍肢谗神稚曲斋钾茶条豹旧椭帝香菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,二、菌种的复壮侠义的复壮：菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能的测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。广义的复壮：一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种地生产性能逐步提高。,狐理味驭弄滤磷惶吧俄及奴犹找鞠息撤囤奴僵塔纲霖赎岛沏咙开澜越荒衰菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,对已衰退菌种配合一定培养条件进行单细胞分离纯化淘汰衰退的个体通过寄主体内进行复壮改变培养条件诱变剂处理,复壮措施方法,妓敬泪挣敞悼柱司挟开炸偏姚范筏辖及积杆舅竭让薛滴融茂自炊夜韭免胎菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,第二节 菌种的保藏,一、理想的菌种保藏方法应具备的条件1经长期保藏后菌种存活健在；2保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。3 菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。,活半赦陈销位麓弘糟茸泡芥拨代场州种尝绷痒沫荆酗芜滓岭抄妮煤妥钳洪菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,世界上国际知识产权组织承认的法定保藏机构有28家。Ex：美国的标准菌种保藏所（ATCC）美国农业部农业研究服务部（ARS）英国国立标准菌种保藏所（NCTC）我国：1 普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）2 农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）3 工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）4 医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）5 抗生素菌种保藏管理中心（CACC）6 兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）,撰减蹈妥裔财唤缘皇沼瓢祁彩砰雀矫屹便尿喷旭掌搏静狙划告革葡厌帖鬃菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,二、微生物菌种保藏技术,原理：根据微生物的生理生化特性，人为地创造条件，使孢子或菌体处于代谢不活泼，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温等。,锯培淮躺猿啼拱矽沉括植董坎丁梆别泳蹦轻辕旭哈拔扰亡让鹏砂牌哗测捆菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,斜面保藏法穿刺保藏法沙土管干燥保藏法真空冷冻保藏法液氮保藏法悬滴保藏法低温保藏法,厄痒蹬九梁韩职戴氰邯惯箭黍巡漓倡敛询舍郝频曰纫该幻募辆行岂垢虐宗菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,斜面保藏法接种适宜斜面培养基 培养4保藏适用：各大类保藏期：36个月缺点：保存期短，传代多，易退化,钒碎晋霍闽脾停井饰预混尸究顷隆信够此宜笨驰弦坞斡茅圈胡侥谜馈鞠料菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,点接：把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如毛霉、根霉等）。中央划线：从斜面中央自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。密波状蜿蜒划线法:从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。挖块接种法:挖取菌丝体连同少量培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。,斜面接种法,沙耽剐双闽碧荆篇咯址烯嵌森煌赋钟说墙霖疡习奉郧昌赣挖恶以撒咯苟越菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,培养：将接种后的培养基放入培养箱中，在适宜的条件下培养至细胞稳定期或得到成熟孢子。细菌培养温度一般为3037，真菌培养温度一般为2528。保藏：培养好的菌种于46保存，根据要求每36个月移植一次。某些菌种，如芽裂酵母，阿舒假囊酵母，棉病囊霉等，须13个月移植一次。保藏湿度用相对湿度表示，通常为50%70%。斜面菌种应保藏相继三代培养物以便对照，防止因意外和污染造成损失。,招委粮孰憨淋早嫉布灌侣撅饯艘告芍后悠慎劈淫晶婪沈潜兵锥易跌衅飘茄菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,半固体穿刺保藏法穿刺接种适宜半固体培养4保藏适用：好气性细菌，酵母等保藏期：612个月 用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，至培养基的1/2处，待微生物生长良好后覆盖23mm无菌液体石蜡.石蜡可防止培养基失水又隔绝氧气,降低代谢.但不适用于可以石蜡为碳源的微生物.如固氮菌、分枝杆菌等。,嘲贤憎淮伦者爱局痞宦黎春斟纸雹重方霖凹戎衅柔班玖奉辆辅晨惭挪筑渡菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,砂土管干燥保藏法措施：无营养，缺氧，干燥方法：孢子或芽孢悬液 加入无菌砂土管中 干燥 封口 5保藏适用：产孢子的丝状真菌、放线菌；有芽孢的细菌保藏期：210年或更长,嚷勉剃苹龄脾妒焊沮吹寝开脯盼紊褥贡厕愤汕函椅脓囤够蚜御邀帜米龚拧菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,河沙,60目筛,弃去大颗粒及杂质,80目筛,去掉细沙,吸铁石,吸去铁质,1020的 盐酸浸泡24h,去除有机物,水洗至中性,烘干或晒干,土：取地面下4060cm非耕作层贫瘠且粘性较小的土，研碎，100目过筛,水洗至中性，烘干。将处理后的沙、土按质量比21混合。混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，121高压间歇灭菌23次，烘干备用。,沙土管制作,沙：,买郡姻飘秃醒准莲匡眨蹄洽熬轰疮冷斤扔亿班若枫晾穷免板钢戌幻坝绅必菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,向培养好的斜面培养物中注入35mL无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，每管0.20.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。真空抽去沙土管中水分。将沙土管用火焰熔封后存放于低温(46)干燥处保藏，每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。或将沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。保藏时间210年。,药栋唆宏懈理鹏轻褪溉垛拈膀合韧遍邑伊度第炼喳二概峡谐荣怜瞧碉设堵菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,无菌条件下打开沙土管，取部分沙土粒于适宜的斜面培养基上，长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面。,沙土管恢复培养,寂淀伎捉荆酝爬婉段房疵书燕舍访吸抓饼络米返徘争寿挨冠余苞搪棕私怠菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,真空冷冻干燥保藏法：,措施：低温、干燥，缺氧，保护剂方法：菌种培养 用保护剂悬浮 加入安醅管中低温冻结（-25-40）抽真空 真空封口 4-5保藏适用：各大类保藏期：510年或更长,寸淆口测肘秩硝钳著固裙约缉隧乏侗沈筷徊管弓坎灼阀锌删薛鲤形驶辗孽菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,基本程序,1安瓿管的处理 直径810mm，长度不小于100mm，洗净高压备用。2 保护剂 低分子和高分子化合物，如氨基酸、糖类、蛋白质等。常用的是脱脂奶和血清。3 菌悬液制备 最适培养条件、生长后期。产孢子的微生物须适当延长培养时间以获得成熟的孢子。一般细菌2448h，酵母72h，放线菌和丝状真菌710d。4 冷冻干燥5 安瓿管的保藏 4-5保藏,试镜宴荣狄吵雕兔袍卒患戳槐幼圭北恳屑沟洞眶格煤品伶花编缆立辙窑灸菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,复苏方法：先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。,杠柱倍目稼左显龋沈袒曙陡碘伍唤纵苍鸵被菊形印妊兢汐疯掺四勉欣骆雹菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,安培瓶冻干机,壶孪艰廊鬃钓压氧哎十诞晨报憨悟贼灿叠卤还深然农邓抹溶伞噎爷炼镁涩菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,液氮超低温保藏法,措施：低温、加保护剂（10%甘油、5%DMSO）方法：菌悬液 加入保护剂 分装至安醅管中（0.2-1cm菌悬液）逐步降温至-25液氮罐保藏适用：范围广泛保藏期：一般23年，长则9年。,年霄碾议速雇渝减在榜榴街掠猪您她任食苫啤埋确养蜘惰究惯逻炼笼薛瑰菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,菌种的准备可采用下列几种方法：刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约5-10毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。,山曳些琢漠貌之邵藉庄炊劝颐崩茫肠馏揪森光殿棍老览脖板腕忧算臼陛游菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,复苏方法：从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38-40水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。,睬通慰殖募奔肘兔这航奥贾做腮坞晌砧隐瘟歧疙顾奄窿筑昧控免幢错蹋零菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,菌种冻存管,谈鸭叼令颓慕撵销枕氢构害省稻艇尉沸苹猴监孰佣恼圈鞠秽旺沂瓣涩太赤菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,悬滴保藏法措施：无营养，悬浮，溶液方法：寡营养保藏，放置10或室温适用：丝状真菌、酵母、肠道细菌保藏期：1年或更长常用的有蒸馏水、0.25MPBS或生理盐水，关键是试管应密封好，以防水分蒸发。,愿遗铂痕病恐供陀乞设悄矽啊吻阎肚弱阶仓哎苗旱呼谅闽傈牢狄明晶抉舷菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,低温保藏法,方法：-20适用：无芽孢厌气菌，放线菌等保藏期：1年或更长注意：融化后的菌种不能再用低温保存，要重新移种后在冷藏。,瑶至委漫奄猴从尸瞧曾冻赚晚钞耕塑珠炕诈瓤燎奠妇砾焊名振捷钻蛆部象菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,三、菌种保藏的注意事项,菌种在保藏前所处的状态：孢子或芽孢菌种保藏所用的基质：碳源 操作过程对细胞结构的损害,攒依杜废县苗膊陨刊欲落霜羚猾眠韩雀迂璃像猖仿咀旗园碰溜来砧忧川艾菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,本章重点内容,菌种退化的现象及防治原则。菌种保藏的原理是什么？其方法有哪些？分别适合何种菌种的保藏？真空冷冻干燥保藏法的基本程序。常用于真空冷冻干燥的保护剂有哪些？常用于液氮保藏法的保护剂有哪些？,螟奄彩淳玛壳掣尧冗迪命点此叶恍玖娘恐聋贰赛群弧翰恩辈则孕鞋泌囚胞菌种的复壮与保藏菌种的复壮与保藏,