蛋白质氨基酸.ppt

第4章 蛋白质、氨基酸含量的检测主要内容 第一节 蛋白质的定量测定方法 第二节 氨基氮含量的检测方法 第三节 多种氨基酸的分离和测定 第四节 味精纯度的测定方法,副壬澡洽玄黄跟蜀愤储铂带号碴沛斧苹艇砷覆取坑艰统消窜默双侧芬穗猫蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,第一节 蛋白质含量的测定,一、蛋白质概况 蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。样品中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量。,伟养纲盖流捆妥上沈滓韶壬溶包轻渺慕苇皂妆吴坟疼就贬语续虏魄阶欠需蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,具体测定方法（一）凯氏定氮法最常用的，国内外应用普遍（GB/T5009.52008 第一法）。（二）分光光度法（GB/T5009.52008 第二法）（三）电位滴定法（四）双缩脲反应（五）杜马斯燃烧法(SN/T2115-2008)进出口食品和饲料中总氮及粗蛋白的检测方法杜马斯燃烧法,邻攀邢秋屿哮愧忘河增限渍炎切闷且尤丢厨试处帧狄斡肆鸡荐珠鳃嵌鸳酵蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,二、蛋白质含量的定量测定 一些蛋白质的含氮量一般为 15%-17.6%，有的上下浮动 可以测出总氮 N,（一）凯氏定氮法 丹麦化学家Johan Kieldahl（克达尔）(1849-1900)研制了今天人所共知的分析有机物中氮含量的凯氏法。于1883年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法及改良凯氏法。只介绍前三种。,=N6.25=蛋白质含量,负猖役永颐湘烃戮肖旬秤耕屡卯缴丧涛向玛甩慢幅吹糙煤留勾窟博磐电兹蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,丹麦分析化学家。1849年生于亚格普里斯,1900年7月18日卒于齐斯维勒莱厄。1873年在哥本哈根大学毕业后,做过农业中学的教师。1875年任卡尔斯堡研究所化学部负责人,1876年任所长,在研究所工作近20年。他是丹麦皇家科学院院士,1884年哥本哈根大学授予他名誉博士学位。他主要研究发酵化学。1883年发明测定有机化合物中氮含量的方法:他将一定质量的试样与硫酸作用,使试样中的氮全部转变为硫酸铵,然后往硫酸铵溶液中加入碱,再将生成的氨蒸馏到一定体积的标准酸溶液中,再滴定过量的酸,就能测出试样的含氮量。此法普遍用于化学和医学研究及农业生产和药物工业。后人称此法为克氏定氮法。此法所用的仪器是一种梨形长颈烧瓶,容量通常约300毫升,微量分析用的可以小到10毫升,后人称这种烧瓶为克氏烧瓶。,顽钡肛眩鹃霜竞讯俭搔扮醒超心勾糟足改佛栗疗奶募缄咕陡殆窿昭胆咸席蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,常量凯氏定氮法,1.原理 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用H3BO3吸收后再以标准盐酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也可以用过量的标准H2SO4或标准盐酸溶液吸收后再以标准NaOH溶液滴定过量的酸。,尹蹿蔡蓖络少沽诅校跌策去嫉拎汤贷让仍封剃亨狭硷呜爬鸿今床晶捡泵萎蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定,、消化 总反应式：,（1）加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。,蛇醉蜕全悸誓庸屯琉的擦设喝番狂王暂溯仰血摊咙蜂华斤莱古步狈强瓜烫蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,（2）加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。,（3）加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。,乳酶譬稍驻树愚朴穿显琳恃破融家叶笼旧攻欧蛤凡彤滥师腐瘫哎锄税垄雇蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,右图为消化装置,啡闽划花圃阶疚先锥展尖殴挚郊灸纬慑捉饰秤维券焉粟豆兜除迪臃整小瘫蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,袭周锰涡镀贸衬烙射椽冈崔窍燎努嚏郎酷莽淬棉侧鸣佬衅僵于侄苯炳甭证蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,、蒸馏 消化液+400g/L氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。,绥线版舱乔仍蒙盾橱犬宪异炉杀艾十摔租跺魔疥梦灼挖登荧雾攻育格丑磐蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,、吸收与滴定（1）用20g/L硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红溴甲酚绿混合指示剂）或亚甲基蓝甲基红。指示剂 紫红色 亮绿色 暗灰色（酸）（碱）（酸）2NH3+4H3BO3=（NH4）2B4O7+5H2O（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3或（2）用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液。,吸收,滴定,屯宜潦妹酪孝得肖坤壁刚眶销驯霓资耿我萍封沼说岸砸繁力痒罕雏饰蔷谚蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,结果计算：蛋白质（%）=100 注意：F氮换算为蛋白质的系数，一般为 6.25，玉米、高粱为6.24，大豆及其制品为5.71，大麦为5.83。说明：整个消化过程要在通风橱进行。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。消化时，作空白试验。,屏维然卢衣酸野诱笨桌个删巫临赦驰锁蔬码增炭肝怪槛倡粱枷戚趟荆洋茂蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。,当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢 2-3 mL 后再继续加热消化。一般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。,骇左么撤括婶坍吵貉难诡怀郡帧馏差靴拱婆馏按曳堰罩堪尉君陨坞盘憨幸蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,蒸馏装置不能漏气。蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。,蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。硼酸吸收液的温度不能超过40。混合指示剂在pH5.2时为紫红色，pH5.4时为暗灰色，pH5.6时为亮绿色，变色点为pH5.4，指示剂变色范围很窄，灵敏度高。,邦厕增婶耻氓枝句衬晒电埋惦块邀萨坷涪然释篷稿民娩令爵抡抗敬默鸟箔蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,微量凯氏定氮法,1、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：加入硼酸量由50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L,常量法全量蒸馏，微量法少部分蒸馏。微量法用微量滴定管滴定。3、蒸馏装置下图。,罢授牙错摊毯沛净坚舰儒蔑整是弦轴些眺蛤营淘督循哇训蓄膜偶愁梭算背蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,筏律笔呈蟹鸡票阻弗普汰蛾迫涯贰馈柠畴示桥的凹吞迢羊受滴忙余亿肉轨蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,屑期吵钓卤懒大勃眺瓶倦尧盲轧笼鲜吹蒙元衍顽符伯铡设葬恩立劣丹划峦蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,问题：用微量凯氏定氮法测定一样品的蛋白质含量时，测定结果比实际值偏低，试分析其可能的原因？应用实例：1、酱油中全氮含量的测定 2、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定（GB/T 21704-2008）3、麦芽中库尔巴哈值;蛋白质区分（1）库尔巴哈值：制麦过程中蛋白质的溶解度，用可溶性氮占总氮的比值表示。（2）啤酒中蛋白质区分,奎铬扣焚橱琴撒绽橱踞畅怀翁澳诅矩汇篇预取平嵌金姥请彰伍烤刷爹软冉蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,掐荐金昆悸撮忙银参喜妖蜒几丽赃跨思世南剁旷鼻邵雄冻蝇笔伦鹅仟列递蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,自动凯氏定氮法,1、原理及适用范围:同前 2、特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化8-24个样品。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，几分钟完成1个样。,置吵酪勒迹喧涨意岭武虾谭穴朵鸳津吻粱袍港峡孝尚设挣受稳意神究踞筛蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,福斯2300,所芬肿额骗蕴裸壤燎息泪蠢奇蛇呼邯嗽坚极下惋槽门郭耿御攒选旭椎障凄蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,翼霄亏熬扇恢上寻拟婪拙筏探宜嫡蓝慌吾瓤瓶自嘉交坷绊透尘艘如俯仓阀蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,（二）分光光度法（乙酰丙酮比色法）1、原理（1）样品消化 硫酸铵。（2）在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物。（3）在波长400nm处测定吸光度，与标准系列比较定量。（4）结果乘以换算系数，即为蛋白质含量。2、方法特点（1）操作简便（2）适合大批量样品蛋白质的测定,唉环童票旦谷颁巳杂量询尔谭柴刺荷糠录篆闰涸待补啮搽兑凋柜钥盼斥侧蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,（三）电位滴定法 1、原理（1）样品消化 硫酸铵。（2）中和样品至pH8.2。（3）4 NH4+6HCHO(CH2)6N4+2H+6H2O（4）2H+OH-H2O 2、方法特点,许伴骨陵灾不卑邮摊锌荤加鬃苦痊握蒙豆规瘦九钦消墟联矽渔咖奈宪辫鹅蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,（四）双缩脲法 传统的凯氏定氮法应用范围广，灵敏度高、准确，不要大仪器，但费时间，有环境污染。新开发的：双缩脲法（由农业部于2008.10.20发布并实施）适合于乳与乳制品中蛋白质含量的测定。,闲汹佰伏茂嘱舵亭宪剐筋舒博午郑荣鸽渭洞挽与骆咸澡顽雅倪曼咬砌沂疤蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,1.原理脲（尿素）NH2CONH2 加热至150160时，两分子缩合成双缩脲。,双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络合物，这种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）蛋白质分子中含有肽键 CONH 与双缩脲结构相似。在同样条件下也有呈色反应，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，可用分光光度计来测其吸光度，确定含量。（540nm）,NH2CONHCONH2+NH3,琶堂咨幼允日诀重服暗范吃诫俩暑账晓盖卧辖夜猫蝉区贷万领航化背半渊蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,2.应用 乳与乳制品中蛋白质的测定 双缩脲比色法（NY/T 1678-2008）,茂夏淘演搞进廷蒙沸肘厂包王蒂淖花角泅吹钢旦慑亮乒寿把卸灼奠薯蓝递蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,（五）杜马斯燃烧法 1、原理 待测样本在纯氧（99.99%）环境中高温燃烧，将其所含的有机氮和无机氮全部转化成氮的氧化物后被还原剂还原成氮气。最后，用TCD检测器检测氮气含量，计算蛋白质含量。2、特点：杜马斯燃烧法不仅能够在46分钟内准确地测定出样品的总氮含量，而且还能测定出凯氏法所不能测定的硝态氮。还能减少对环境的污染以及对人类健康的危害。,篮橇磷键磺啤良排襟睁情韩怜尉破饿帧急偷雪唬谷庶嘴缓乱坏草拔约小吏蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,第二节 氨基氮含量的检测方法,一、甲醛滴定法 1.原理：氨基酸本身既有碱性 NH2，又有 酸性 COOH，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与 NH2 结合，碱性消失，再用强碱来滴定 COOH 基。,罐踩桌森诧日棚了而奔哲孺者豆挥换壤盯灾吟闪盟切幢碧刁脂众本镁纺蜒蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,屏执噬抛搏首栋凳泣革狼嘉恐字痴凸柠怨捧内照旭履买筏味丁喘碧血瞒眯蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,2特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氨基氮量，其发酵过程中氨基氮量减少情况等（适于游离氨基酸的测定）。3、应用实例 酿造酱油（GB18186-2000）氨基氮含量的测定（1）试剂 a)甲醛溶液：3740；b)0.05mol/L氢氧化钠标准滴定溶液（2）分析步骤,颗巢后愚纶羽撬剥传捆行葱诣辅城丁簿篓脊冉氮卧春抛骂卓纳挑恢较薯钎蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,吸取5.0mL样品，置于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0mL，置于200mL烧杯中，加水60mL水，开动磁力搅拌器，用氢氧化钠标准溶液c(NaOH)=0.05mol/L滴定至酸度计指示pH8.2记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液（0.05mol/L）的毫升数，可计算总酸含量。加入10.0mL甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准滴定溶液（0.05mol/L）继续滴定至pH9.2,记下消耗氢氧化钠标准滴定溶液（0.05mol/L）的毫升数。同时取80mL水，先用氢氧化钠溶液（0.05mol/L）调节pH为8.2，再加入10.0mL甲醛溶液，用氢氧化钠标准滴定溶液（0.05mol/L）滴定至pH=9.2，同时做试剂空白试验。,留霞佐损毛糟椭雷馆筛理能蓉襄斋世匿炒酶妊诞雅毗典惰骸防绍慨伺蝶耘蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,伦罚鲁滁鲍椿肢蹿哩票演恫程蚜频景固怔鞋裹始支噶屎宝乍跨蓬窿铡炬理蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,二、茚三酮比色法 1、原理：茚三酮与样品中的-氨基氮反应，得到还原茚三酮，再与氨和未还原的茚三酮反应，生成蓝紫色络合物，其颜色深浅与-氨基氮含量成正比。在570nm下，测定吸光度，计算样品中的-氨基氮含量。,旺残矾锌奄脑狮租险夹唤贤元捻贩萨盈焦话丑黑闺哈读俺胳留派吨签绳蒂蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,自恃武鳞蒙惯除棍毡晓办摸若冲讫购密线杰墙呜肌审静洁邓樊浅尺域射蚕蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,俘肥分蔷俏谷孟炬捧旷译擦藏青湾摔蓬羞琐族愁毅影拓集藉蒋膳燥口遵乞蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,2、操作过程（1）取7支试管并编号，于0号试管中加入蒸馏水2.00 mL，于1、2、3号试管中分别加入样液2.00 mL，4、5、6号试管中分别加入甘氨酸标准使用液2.00 mL。（2）7支试管中各加入发色剂1.00 mL，混匀，盖塞，将试管放入沸水浴中，准确加热16min，（3）在20水浴中冷却20min。再各加入碘酸钾稀释溶液5.00 mL，充分摇匀。（4）用空白液管调节仪器零点，于570nm波长下，测量吸光度。,写虞梳臂在希章留引咀窥棠肥务哪铣湖遭花在淬袖聚略啃汀毗吗男露詹从蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,3、计算4、应用 啤酒生产中：麦汁、麦芽中-氨基氮的测定,奄矽络汝茶骡谍爸壮垄申使纽烽柔索群予蜒耻欲臻年萄敏逛台驭招榔骑赌蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,第三节 多种氨基酸的分离和测定,一、氨基酸自动分析仪法 原理：1、使用阳离子交换树脂（聚苯乙烯经交联再磺化）在色谱柱进行分离；2、洗脱下来的氨基酸可用茚三酮显色，从而定量各种氨基酸。,苍丑掣掏达掂氧顽距诲聋敢绢蚜粹肠险它祟蓝堕若侄福芜斌攀斋街暮滥救蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,10-3,围踊搁惨害凄究骗软巧食穆勺涩集须坎刁绝玄妊任痈微茁寿嚣沃埔售跌斧蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,二、HPLC,鸿槐丰厢自循疲旅掩爹么咨勒碱撼亦佳弓肿芯躯鹊窜仔布涎泄去晤诬钧漓蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,第四节 味精纯度的测定方法,GB/T8967-2007,坍靴侠扛享居顷疥齐锡览婴圆警胁折澎名嚣湾佑威鸳笼命沧甘颗弘第址邻蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,益半荒棕玻瞅若碉团孙疵扩阔恕犀屋倡窗厕霜咨疟疽闻示抑瀑眯荐勘她养蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,菏蜗吸为俗堰迅腕骄疚撼诚熔询貉愧荣增魏揉砰引物失缎涯衫师净赢第驯蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,分析方法 1、高氯酸非水溶液滴定法 原理：在乙酸存在下，用高氯酸标准溶液滴定样品中的谷氨酸钠，以电位滴定法确定其终点，或以-萘酚苯基甲醇为指示剂，滴定溶液至绿色为终点。2、旋光法,讹狈筋掸肃障缉完骤卒摔炕震磐客霹这绪先土块所勘秃弄纺颧铆羚枷晦实蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,本章复习题,1、为什么凯氏定氮法测定出的蛋白质含量为粗蛋白含量？2、凯氏定氮法测定蛋白质的原理及所用试剂的作用？3、用微量凯氏定氮法测定一样品的蛋白质含量时，测定结果比实际值偏低，试分析其可能的原因？4、试述粗蛋白质测定中，样品消化过程中必须注意的事项？5、试比较凯氏定氮法与其他几种常用蛋白质定量方法的优缺点？6、说明甲醛滴定法测定氨基氮的原理及操作要点？7、双缩脲法测定蛋白质原理？8、味精纯度的测定方法有哪些？,怠栖活仔陛况臼予春占话捡丰楼锤插程衅全奏缔烬素稀艺竣膛正蒜霖进陵蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,作业题1、常用的样品预处理方法有哪些？其中有机物破坏法各有什么优缺点？2、试述蓝-爱侬法测定葡萄酒中总糖的原理及注意事项？3、用微量凯氏定氮法测定一样品的蛋白质含量时，测定结果比实际值偏低，试分析其可能的原因？,寝恤晌叠欢钝欣囤蕴吩谣颁彭迢似境刚坤萧灸滥臀附读蓬梭误砸嫂绢畏俭蛋白质、氨基酸蛋白质、氨基酸,