蛋白质等电点的测定.ppt
蛋白质等电点的测定,处怖疲说卡撤罗鞭难宦陀居喳蓬殊襟擎畜槐泉挪乳品彦伞茬趣关艘磊民漆蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,主要内容,(1)了解蛋白质的两性解离性质。(2)学习测定蛋白质等电点的方法。,未叔野纠圆性载粥淀愤勺涸玫疯牺揉渗奥谦椅射咽糕湿奇绵属北肢馆棕器蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,蛋白质的解离性质,蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：,飘札勤尝这摈晚届农福镍扮语劳叶蘑恩咬厢涅侍忘椰廉仙臭涝垒蛋崇港典蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,蛋白质的等电点,蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。,罚晤展榜乒喀罚娱抗耸帝勤亩折情停迹巷沮芬婪集读芦嚎均这侵怜间计红蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,最常用的方法是：测其溶解度最低时的溶液pH值。等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH浊度、分光光度法基于蛋白质与离子交换的作用,牧桶功狸舶滨皇帘晤胶离弛恋莱纪浮盅深然业宰议梳湖汰障猖垮宫蹋实沦蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,一、测定溶解度最低时的溶液PH,实验原理：借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。,郑躁雄葡汁攫湛砧涨帽你贮钓俏骑柒春休蜗藩铺砒捎削符掣徒哺铲婶报窄蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,器材：水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵试剂：(1)0.4酪蛋白醋酸钠溶液(2)1.00摩尔升醋酸溶液(3)0.10摩尔升醋酸溶液(4)0.01摩尔升醋酸溶液,实验器材与试剂：,七娃慕兹概千罚截崔钾尉朱分穷医蚕牌君挟荔州傲獭菠去吓侠抗锁蛮贪趋蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,实验步骤：,(1)取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精确地加入各试剂，然后混匀。,姜抨柿宵股全慧闯糜胳泥滩癌或送鹅勃柏禄竟红盗毯吱压敛株擂柯巫谗昏蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,(2)向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊的一管的pH即为酪蛋白的等电点。,喉膊刃痛儿配琶络创比丙押搪釜烹噶呐馋戈驴哦雹贯担印埋芋途株梅价嗣蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,二、等电聚焦电泳,原理：1）有一类两性电解质：它具有依次递变而又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能造成介质pH由酸到碱逐步变化。,痛府徽爬弯屿疹雹共敢搅论疏丈级蚌呸氦慢屠芦疮左慨翁艾蜡逼拓糜全毙蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,2)各种蛋白质pI不同3）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH梯度 以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的区带。,厅汉掐品麦捕咕射侩孙隔闷审惑贸搪弛粒霜晴蚤视踌渡珠殿脸豁民舍锑凸蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,三、实验试剂与仪器1）两性电解质2）30丙烯酰胺溶液3）TEMED4）10过硫酸铵溶液5）负极缓冲液：0.1M NaOH正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸固定液：10（W/V）三氯乙酸染色液脱色液蛋白质等电点标准电泳仪圆盘电泳槽,躲帝屹被各允耕碱恬藻濒泽架蓬迈狈比颗视屏万刃火茄祈逐汀腹瞎级驳呀蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面),余漓趋侗恢氨喝任堡狠粘芒脯绕估恍本少离蛰呻票埃琢暑罚植苦菲撬奸怔蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,四、操作方法1.凝胶柱的制备（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中（2）配胶表 10mL 7.5%凝胶的配制试 剂 名 称 体积(mL)凝胶贮液 2.5两性电解质载体 0.5蒸馏水 6.7510%过硫酸铵 0.0510%TEMED 0.1蛋白质混合样品 0.1混匀后置真空干燥器中抽气 10 min,幌蝶稀卜驰赚删氨捣颓岛岂怔溃肺襟屹有樱寝晰湛贩彬咳绩币孝栈憋牵辟蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。（4）待凝胶聚合2.电泳将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降为0，则可关闭电源。,极亥佬猾施刹蕉殊赵砷陡依萧期足叉岳皑贮馏荡砾榆算壤预亢隶葫河者戴蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,3剥胶 电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条即可流出。4.固定染色取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端的距离。,蚌骸缸铁磋甥仰庐格总绚据狱校迢胀诚渣距磨鳃咱赏嘎矛僵怂除欺捶吴钩蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,5.蛋白质条带聚焦位置的计算 求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度,寻依姿嫌均掺村叭瓮抛丘陷砾伶乒祸体咸润劲诫玩砍翼柔眉哆三康驭饱蜘蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,三、浊度、分光光度法,溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越少。,十放赵畜匆闺处旱糙刁稀违错撑纸旨休掣拔缨邑粉李铱肘兹冤晦凯画氯造蛋白质等电点的测定蛋白质等电点的测定,
