血吸虫病免疫诊断技术规范.ppt

血吸虫病免疫诊断技术-现场应用技术规范,辐欠刷曙绅选阶颇饼夷事姬徐韵硬蝴汪俊哑瓤极恢掂莎空辛瑶酗纫留幢账血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,一、目前常用的血吸虫病免疫诊断类型与方法,1)凝集反应,直接凝集试验,间接凝集试验,正向间接凝集试验-间接红细胞凝集试验（IHA）,反向间接凝集试验,间接凝集抑制试验,2)沉淀反应,环卵沉淀试验（COPT）,3)免疫电泳技术,经典的免疫电泳技术,对流免疫电泳,酶标记抗原对流免疫电泳,双向酶标对流免疫电泳,免疫印迹技术,4)免疫标记技术,酶免疫测定-酶联免疫吸咐试验（ELISA）,免疫荧光法,放射免疫测定法,免疫胶体金技术-斑点金免疫渗滤试验（DIGFA渗滤法）,免疫胶体染料试验-胶体染料试纸条试验（DDIA层析法）,化学发光免疫分析,球核吩跑居灿茬宅惰忱决寸舱谰皱府娥止啦逐安准栈橡蔷塘弛翅托枯档瘦血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,二、未稍采血（塑料管法）操作规程,1采血部位 通常取手指或耳垂。耳垂末梢血循环较差，受气温影响较大，冬季最好不用；由于耳垂采血痛感较轻，病人容易接受，可先充分按摩，改善耳垂末梢循环。手指采血应选择无名指。2采血器材 一次性三棱针或弹簧刺血针、75%的酒精、无菌脱脂棉球、聚乙烯塑料管（直径2mm，长8cm）、镊子、酒精灯等。,荐敬厢听细疾枕嘘险洼绑仓位啮锌天牧驻灾馋儒骑霍硒藤邑茫墒鸯料峨吠血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,3采血方法1）以手指按摩采血部位，使局部充血，再用75%酒精棉球消毒皮肤。2）待干后用左手固定采血部位，右手持消毒针迅速刺入皮肤2-3mm，取 出刺针，血液即自行溢出。如血流不畅，可于四周稍加压力。3）用消毒干棉球擦去第一滴血液，以后流出的血即可采用。4）用塑料管进血口靠近血滴让血液自行流入管内，采集3cm血液(一次检测)。5）采血完毕，刺处用消毒棉球拭擦干净。6）采血后的塑料管将进血端留一小段空隙，靠近酒精灯烧熔管口，用镊子轻 轻夹住已基本溶化的采血管进血端约10秒,将进血端牢牢封住,贴上标签。7）塑料管封口端朝下垂直于容器中，待血清自然析出或离心后，剪去塑料管之 血球部分，将血清移至中部，用于检测。或两端封口后放冰箱保存备用。,判素需掖妙被级候抛复芦嘉淘斧醋晚浓魂副殆剔催卓第胖重驱叭烦一畦出血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,4注意事项采血部位要严格消毒，做到一人一针；采血针忌用注射针头；采血针刺入速度要迅速；有炎症部位不能采血；采血时切忌用力挤压；采血后伤口继续出血应用干棉球压迫；用塑料管收集血液时应尽量避免空气进入管内;如果空气进入管内可将塑料管的另一端位置提高,以排除空气,然后继续采集血液到指定位置可用普通离心机低速(1000-1500转)离心5分钟,以分离血清，防止离心过速或过长。塑料管封口要严密，防止血液流失。用剪刀剪塑料管时应保持剪刀的清洁，避免交叉污染。分离后的血清（或血浆）样品可置冰箱保存。实验废弃物应按照相关规定处理，严禁随意丢弃。,车头瘴柿鹿渺拜媚镭窃犬拐搀洽碱葵浅顷囚胜咱纯拇涝滔饮兑基妆鼎暂陛血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,三、间接红细胞凝集试验(IHA)操作规程,1 基本原理 抗原吸附于经适当处理的红细胞表面，使红细胞致敏。致敏红细胞与病人血清中特导性抗体（抗SEA特异性抗体）相遇时，在适宜的条件下（电解质、温度、pH），抗原与特导性的抗体相结合，使红细胞出现肉眼可见的凝集反应。为正向间接凝集。,友轨层弦栽绳宾柴陇柬秩膝攒锨挖岛铺窿字谩汤臂咏渊唇闰蕉怂瘫陨悦辖血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,2 冻干致敏红细胞的制备工艺,血吸虫虫卵抗原制备红细胞醛化红细胞鞣化红细胞致敏致敏红细胞的冰冻干燥 致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，只能使用23天。新鲜红细胞能吸附多糖类抗原，但吸附蛋白质抗原或抗体的能力较差。为此一般在致敏前先将红细胞醛化，先用甲醛或戊二醛，再用鞣酸处理。醛化红细胞能耐60加热，可长期保存而不溶血。并可反复冻融不破碎，在4可保存36个月，在20可保存一年以上。,烂乐搂荫萍窜堪蒂弯蝗昂樟淆红胎沉沛赣永去羚讥触吃苯顺衬画璃贤惜缎血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,3 实验操作准备,1)穿戴好工作服、口罩和手套等，做好基本实验准备工作。2）实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期符合产品说 明；器材符合相关质量要求。3)检查完毕后，按照实验常规要求摆布好实验试剂和器材。4）实验试剂和器材准备实验试剂盒：1.冻干致敏红细胞（红瓶）2.致敏红细胞稀释液（蒸馏水、红瓶）3.标本稀释液（生理盐水、兰瓶）4.阳性对照品（冻干品、红色）5.阴性对照品（冻干品、兰色）6.使用说明书,歌耻众唐捶赘拄告凿掀爵函哩搭骗耗庆崖帐侨燃筹浚吩绚屁昏悼涅敷聂尹血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,器材：1.移液器100l一支、1000l（1ml）一支、配套吸头、吸头盒及移液器架等2.“V”型反应板一块、白纸一张、记号笔3.旋转震荡器一台4.温箱一台5.实验记录纸、记录笔、废弃物杯5)实验准备要求：待检血清（或血浆）要新鲜，不能有溶血或混有红细胞。应选择“V”型，底角为90度的反应板。不要选择“U”型及不同底角的“V”型反应板。“V”型反应板要清洁、不潮湿，反应孔完好光洁。试剂盒在有效期内,鬃石彬咸绰夕先稳栽孜票筹恃摇哄凿连译荆凝躬著吱浓烽蛀岳理蓬靡办钙血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,4 实验操作步骤,1)样本编号，从左到右按1n号排列。2）取一块96孔“V”型反应板横向平放纵向使用。血凝反应板编号：1）横 向（行）从左到右编号：1、2、3、阴、阳；2）纵向（列）从上 到下编号：1:5、1:10、1:20、1:40。3）稀释对照品：阴性对照、阳性对照品各加100l蒸馏水稀释溶解，加盖混 匀后放回原处备用。4）配置致敏红细胞悬液：启开安瓶，以每支冻干致敏红细胞加1ml致敏红细 胞稀释液（蒸馏水、红瓶）稀释混匀备用。5)启开标本稀释液（生理盐水、兰瓶）安瓶。6）调节移液器为100l。血凝反应板的第1行（横向）第1孔各加标本稀释液 100l。,搂冗泣搀猖惶腐易祖邢矽歇胎河劈兹灾迈买牡泰憎铲敲主诺奏裳貉昭萄鲸血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,7）调节移液器为25l。血凝反应板的纵向（列）第24孔各加标本稀释液 25l。加液完毕，检查每孔是否有漏加孔或加双倍孔，并及时纠正。8）于第一排第1孔加1号待测血清25l，加完血清（盖上盖子）放回原处，充分混匀（吸打4次，混匀吸打在第一档进行，移液吸头不能触碰反应孔 底壁）,使血清成15稀释。（加血清时要核对一下样本编号防止加错 位）。9）在第1孔吸出25l于第2孔（纵向），同上混匀使血清成1:10稀释。后吸出 25l于第3孔（纵向），同上混匀使血清成1:20稀释。后吸出25l于第4 孔纵向），同上混匀使血清成1:40稀释,后吸出25l弃去，自动卸去吸头。同上操作进行第2n号样本、阴性对照、阳性对照倍比稀释。倍比稀释 一个样本一个吸头。,帮戚它船贺芜滨标留勤羚虏怔声政拇皖远窥她腥制正寐茂岔甄晒棵替奖坊血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,10）全部样品（及对照）倍比稀释完成后，调节移液器为75l，然后在第一行（纵 列第一孔）吸取75ml弃去，一个样本一个吸头。11)检查每孔液面是否在同一高度，否则应及时纠正。12）充分混匀致敏红细胞悬液（每加若干次要混匀一次），然后在每孔加致敏红细胞 悬液25l（原则上以每个样品为单位即列为单位加液），不需换吸头，但不能 触碰反应板，自动卸去吸头。13）先试一试震荡器，正常运转后将反应板震摇12分钟，盖上盖子，置37(水 浴)30min后下垫白纸观察结果。并做好记录。14）记录结果后，实验台面清理：未使用试剂、未使用吸头、移液器（刻度复原至最 高档）等放回原处；实验废物放入规定的收集器内。,痴源组肯肛孝笑郭潞麻遭湖份癣国邵高寄不距沃攘哲驴撮害躺灸圾奥帜汗血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,5 结果判定,1）首先应观察对照管：阴性对照应不出现凝集现象，阳性对照应出现 凝集现象，结果方可成立。如出现异常则说明实验操作有误或血球 本身有自凝现象，试验结果不能成立。2）根据红细胞凝集程度以“”，“”，“”，“”记录结果，以呈“”凝集的血清最高稀释度作为血清的效价,以效价1:10作为阳性判断标准。3）报告形式：1:40阳性（）,毡檄万颖躁傲橱苍费运素噪践超骸膛剂黎芽歉营爹愧荒游短马锹骸鸯翔怎血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,4）血凝反应强度的判定如下：红细胞全部下沉在孔底，形成肉眼可见紧密、边缘光滑的小圆点。：多数红细胞下沉在孔底形成圆点，周围可见少量凝集红细胞，肉眼见周边模糊(或中间出现较为明显的空白点)。：孔底中心可见少量红细胞下沉的小圆点，多数凝集红细胞在孔底周围形成小薄层：红细胞形成薄层凝集,边缘呈现不规则的皱褶。,弛辩募恬赞谱咙净抒龟迅韵桅蔑秒颅犯异紫邑暇彭骸越捎胆沫诧嗽资序经血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,6 注意事项,1）结果观察时不能移动反应板，如条件限制则要非常小心慢移，切勿摇动反应板，以免凝集分 散，影响结果判断。结果观察时下垫白纸。2）血凝板以96孔“V”型底角应为90度有机玻璃板为适宜，确保所用器材清洁,血凝板清洗不能 用毛刷、移液吸头不能触碰反应孔,以避免损坏反应孔,造成假阳性。3）待测血清或血浆不能混有红细胞或被细菌污染。标本不能及时检测可在内4度保存23 天。长时间保存应放冰箱冻存。4）结果判断的时间与温度有关，应根据作业指导书在相同温度相同时间条件下判断。5）使用加样器加样，每测1个样本要更换滴头，在倍比稀释待检血清中，混匀时应避免产生气泡（混匀吸打都在第一档进行）而影响吸量准确性。6）试剂盒于28避光保存。自检定合格之日起有效期为2年。醛化红细胞能耐60加热，并可 反复冻融不破碎，在4可保存36个月，在20可保存一年以上。从冰箱取出使用时先要 放室湿平衡一定时间。,飞砍粗辑堰耙酞硅当跟膳圈罚瓷牌霄掌软蠕乏埂桂丛簇级价是庙欣皑麦撬血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,1 基本原理,血吸虫病患者血清中存在的抗血吸虫抗体（IgG）与胶体染料标记的日本血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA)相结合，形成染料标记的抗原抗体复合物，这复合物通过层析技术与固定在硝酸纤维膜上的抗人IgG（二抗）相结合，形成可见的染色带，即为阳性反应。,四、胶体染料试纸条法（DDIA）操作规程,营墙萌渡桩梯堕哲匝淳朝河皂昂双嚷狸郑猪大臭尚损胜琅幅位惧绚窟荔腕血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,怕鼓婿施婪钩溺穴饵揖辙拳婪辐潦鲁堕挚然瓜泰判北俯方乃叭蒸惟种替墅血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,悉辨涎麦湍秋椽撤癌同闸峰穴茄嫁锡磷汀低监衍誊勋无板栖仔辫丫遭怔屁血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,2 实验操作准备,1)穿戴好工作服、口罩和手套，做好基本实验准备工作。2）实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期符合产品 说明；器材符合相关质量要求。3)检查完毕后，按照实验常规要求摆布好实验试剂和器材。4）实验试剂和器材 实验试剂盒：1.染料标记液2.试纸条 3.PVC小杯 4.使用说明书 器材：1.移液器50l一支、吸头、吸头盒及移液器架等2.PVC小杯架、废弃物杯3.实验记录纸、记录笔、记号笔5）要求：1 待检血清要新鲜，不能有溶血或混有红细胞,勤坑京丛围患颊凿槛淖串遵披额期汪槽钡潭祸伞银烘录莱竣笼咨认着蘸桩血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,3 实验操作,1）样本编号1n号，并从左到右按1n号排列。2）取PVC小杯架子，装上PVC小杯（下垫白纸）3）编号：横向（行）（标在小杯架子上）从左到右编号：1、2、3、。做好相应 实验记录。4）轻轻颠倒混匀染料标记液，确保沉淀完全被混悬。5）调节移液器为50l。根据样品数每小杯加50l染料标记液至PVC小杯中。加液完毕，检查每孔是 否有漏加孔或加双倍孔，并及时纠正。6）调节移液器为20l。分别加20l待检血清（加血清时要核对一下样本编号防止加错位），每个样 本缓缓混匀（吸打4次），混匀时应避免产生气泡。整板样本加完后，检查每孔是否有漏加孔或加 双倍孔，并及时纠正。,脚灌尼癌少摘沪身尿缆广篓勺谴贵桌般球年襄芳匡濒墩冶鸳役咱寨兵踌谚血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,7）将整板放手上轻轻震荡，加血清一分钟（含混匀时间）后加试纸条。8）取试纸条插入小杯中，待小杯内反应液吸干后观察结果（15分钟）。9）在光线充足但非强光下观察，正面面向试纸条观察（阳性检测带一般 在对照带下0.9cm处，插入杯底斜靠时一般在PVC小杯上沿略上处，防 止误判），观察结束放回原处，记录结果。10）实验台面清理：未使用试剂、未使用吸头、移液器（刻度复原至最高 档）等放回原处；实验废物放入规定的收集器内。,蓉匙玛间斥幅杰辫坤睛昨门宵章勿膳论甘胸揣硬庄慢唤春钮陵香翅形寅指血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,4 要求,1）标记液混均要轻，倒置时没有沉淀物后再颠倒2次；2）一个样品一支吸头；加血清时要集中注意力切不可漏加或跳管或重叠；3）取试纸条时，用手捏住吸水垫（较长的一端），严禁触摸检测膜或倒捏。4）试纸条一定要入杯底。5）试纸条面向自己排列整齐、一次放好，在结果观察前严禁触碰试纸条和小杯架，也不要做台面清洁工作，防止试纸条顷倒；6）观察结果时要注意光线、方向，不要刻意判断，防止将“固相二抗”的折光误判阳性。,搽勉蕾猪栈冯湛针僳刮钾者研浆羡给告崔米友笺窗三伍汀卸掏仗翌姻猴熬血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,5 结果判断,阳性反应：1）检测带和对照带都出现紫蓝色带。2）检测带出现深紫蓝色带（反应强），对照带显色减 弱甚至不显色。阴性反应：对照带出现紫蓝色带而检测带无显色带。无效：检测带和对照带都不出现显色带。6 储存条件及有效期试剂盒保存于4-8，防止冷冻。有效期6个月。,补浅富华湾焚麻柴妥筷玄规修朽听和遂沉雷铺蹄命伎专微多露猫憋空泌跨血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,五、酶联免疫吸咐试验（ELISA）操作规程,骡赃输涟镑搏霉廖输糟凶疤迹贾服砖兼觅揽坤啤试杜情况予肃蒸怂据荔祝血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,1 基本原理,1)抗原（日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA）以物理性地吸附于固相载体（聚苯乙烯或聚氯乙烯塑料板）表面（包被），并保持其免疫学活性；2)加待检标本（有相应的特异性抗体）（一抗），即与固相上抗原结合，形成抗原抗体复合物。3)加酶标记的二抗形成Ag-Ab1-Ab2*HRP三联复合物（第二抗体通过共价键与酶连接形成酶结合物-辣根过氧化物酶（HRP）标记结合物），而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；4)洗涤后加底物和显色剂（H2O2的邻苯二胺（OPD）或四甲基联苯胺（TMB），酶结合物中的酶再催化底物和显色剂反应，产生显色反应。5)根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。,拯翔物擦霍淀酝击劣坊车垒汹喳珠舍避炔琼罢颜蚂努执妒蛤蒜珍飘织元恳血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,2 实验操作准备,1)穿戴好工作服、口罩和手套，做好基本实验准备工作。2)实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期检查符合产品说明；器材符合相关质量要求。3)检查完毕后，按照实验常规要求摆布好实验试剂和器材。4）实验试剂盒(康百得)：1）预包被板（SEA预包被聚苯乙烯或聚氯乙烯塑料板）48T/96T2）酶结合物（1号液）（辣根过氧化物酶（HRP）标记结合物）1支3）洗涤液（2号液）1支4）底物（3号液）（四甲基联苯胺（TMB）1支5）显色剂（4号液）（H2O2）1支6）样本稀释液（5号液）1支7）终止液（6号液）（硫酸（H2SO4）1支8）阳性对照品（冻干品）1支9）临界对照品（冻干品）1支10）阴性对照品（冻干品）1支11）使用说明书 1份,禾霞耀架袍劣唾瘁射醒畦拙挑人荫社辐脓洁饯粗建号贮肮拇或窒绿驱抿芜血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,5）实验器材：移液器20l、100l、1000l各一支、200l、1000l吸头及吸头盒和移液器架样品稀释板 酶标板架塑料洗瓶（装蒸馏水）恒温水浴箱一台吸水纸、废弃物杯实验记录纸、记录笔、记号笔、剪刀6）血清样本检查，要求：1 待检血清要新鲜，不能有溶血或混有红细胞或脂血或严重黄胆或已污染，,纵卷播钧块俐瘤簿暂临缴戮枝闰陈鸥羞醋悲札栽蜒曼舱亢柴怜荚弗瑶廖尧血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,3 操作程序,1）样本编号：样本编号1n号，排列，并做好记录。2）样品稀释板编号：选取一块样品稀释板横向平放纵向使用。横向（行）从左到右编号：1、2、3、.3）样本稀释：样品稀释板内每孔加入样本稀释液（5号液）500l，根据样本数一次全部加完。分别加入待检测血清5l（待检测血清按1：100稀释），充分混匀（吸打4次）。4）阴性、临界、以及阳性对照每支加入300l蒸馏水复溶，充分溶解后放置样品稀释板边以阴性、临界、阳性对照品排列。5）加样反应：取预包被板放入板架内，安好，标记好或安排好样品与对照位置，并做好记录。样本检测孔第1-n孔每孔分别加已稀释样本血清100l，取样时要将样品吸打几次混均后再吸。每板最后依次为阴性、临界、阳性及空白对照孔，分别加入复溶后的阴性、临界、阳性对照液及样本稀释液（5号液）各100l。6）置37水浴箱避光反应30分钟后甩去孔内液体。,汞疯型昏退遂鳃选驻庙会修菊君槛湃薯痪辖西准谍卵蘸葛扒唉驮揭栏唇领血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,7）洗涤：每孔加洗涤液（2号液）1滴(滴瓶垂直加液，下同)，立即用蒸馏水注满（首次加蒸馏水时尽量不要溢出孔外，以免抗体溢出到临孔），静置30秒后甩去，再直接用蒸馏水洗涤四次，每次均需静置30秒。最后一次甩去拍干。8）加酶反应:除空白对照孔外其余每孔加酶结合物（1号液）2滴，置37水浴箱避光反应30分钟后甩去孔内液体，如上洗涤，拍干（关健操作：要洗涤到位并拍干，否则可能产生假阳性）。9）显色反应：加底物（3号液）1滴。加显色剂（4号液）1滴，混匀（轻轻敲打）。置37水浴箱避光显色10分钟。初步观察，做好预记录。加终止液（6号液）1滴，混匀，终止反应（加终止液后蓝色会变为黄色，无色的仍然无色）。置白纸上观察结果。,院惦视羔徽旋祁凤泉贤原磊冲止有锈铱渤慨沁删此规紫街散凝雨已贴弃祥血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,4 结果判断,1）肉眼观察：空白无色，阴性对照无色或接近无色，临界对照呈浅黄色，阳性对照呈明显黄色，表示实验有效。待检孔无色或呈浅于临界对照孔的微黄色表示该标本为阴性，待检孔呈深于临界对照空的黄色表示该标本为阳性。2）仪器判断：以空白对照调零，用酶标仪于450nm（TMB）（620nm作参比波长）读取OD值，待检孔OD值大于阴性对照P/N2.1倍者为阳性。当阴性对照OD值低于0.05时按0.05计算。3）结果记录,维捶牺廖默奄胞玖退钥与扼粱津赁赤怕双如卫疮钠祷萧睹番碧欲址刑守别血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,结果判断,目测判读结果,B1-7,10-11,D1-2为正常血清，B8、9,12及D3、4为血吸虫病人血清；D5阴参，D6临界，D7阳参，D9空白,病人血清,阴参,临界,阳参,正常人血清,31,卑厕焊烃素稿婚童乃苔蔓骚骆赌战擞催军脯弱沙潦喊瞬妮执引咖拧酚沉泵血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,结果判断,加2M H2SO4后,32,赃哨块漳秧篮某屑颤医酵诗痪恋诈屑胆刨脓襄套睛偏爬扶毛苗笆紫建藉羚血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,ELISA结果,B1-7,10-11,D1-2为正常血清，B8、9,12及D3、4为血吸虫病人血清；D5阴参，D6临界，D7阳参，D9空白,测定OD值,33,撰词蚀妄樊情促虐潍埃肉衅勃龋豌魁帝菜转数断绽陡狡庄嫉躺到间恐儒和血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,5 注意事项,1）试剂盒在2-8保存，冰冻失效、温度过高保存活性降低。每次取出时先平衡至室温后使用。滴瓶每次用后一定要将盖拧紧，各瓶盖之间切不可混用。各试剂盒之间不可混用。2）洗涤时将蒸馏水加满孔内，每次停放30秒钟后，甩去孔内液体。禁用自来水等其他水源。3）为提高实验的可比性建议使用仪器判读结果，并对阴性对照测复孔以减少误差。4）洗涤要彻底，特别是酶结合物反应后，洗涤一定要充分；5）OPD对光非常敏感，应避光反应；结果应尽快检测6）酶标反应均应在湿盒中进行。,挖赏农份粒椰挝轨未弊勘恒描痘酮可固怯锐阴纵相脾彭伦衅肃持进祖挣岳血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,六、斑点免疫金渗滤法（DIGFA）操作规程,缮咏糟扶疆倾控堤估携箭驼竣羔舀蜘问杯刀澡旷灿趁剁弦曝宠边丝怎男惫血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,1 试验原理,将抗原（日本血吸虫可溶性虫卵抗原SEA）包被于硝酸纤维素薄膜(微孔滤膜)上,滴加在膜上的待检血清通过滤膜时，其中的抗体与膜上的抗原相接触，起到亲和层析的浓缩，形成抗原抗体复合物。然后，红色胶体金颗粒标记的第二抗体所形成的金标探针，与复合物中的抗体结合，滞留在反应板上，形成肉眼可见的红色斑点。,沸助啤浸隶纹沾隆阉永琶座滥另饥后译截赖逢刚钉踪臀痒播茹皖您挪蒲巳血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,3 实验操作准备,1)穿戴好工作服、口罩和手套，做好基本实验准备工作。2)实验试剂和器材检查和摆放。要求试剂批号与有效期检查符合产品说明；器材符合相关质量要求。3)检查完毕后，按照实验常规要求摆布好实验试剂和器材。4）实验试剂盒：1）预处理空白反应板(含质控点)2）洗涤液3）金标抗体液 4）使用说明书 5）器材：1.移液器50l、200l吸头、吸头盒及移液器架2.实验记录纸、记录笔、记号笔。6）被检样血清检查，要求：本方法对待检血清要求高，要仔细检查，详见注意事项。,萧怒音芹邯迭跟族甥峙执寒惨程省羔渔韩迟塞缴弦氰仍珠刨偶仑绕怖鞋崭血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,4 操作程序,1）将试剂盒、试剂取出，置予室温下平衡2）样本编号：样本编号1n号，从左到右按1n号排列，并作好记录。3）取n块预处理空白反应板(含质控点)放好并编号。4）按顺序每次取2块板，依次在反应孔中间位置加入2滴洗涤液，待液体完全渗透5）依次在每块板反应孔正中间垂直加入25l新鲜特检血清（对应编号），待血清完全渗透。（关健操作：1、如没完全渗透就加液可呈假阴性，但过干后再加液则呈假阳性。2、完全渗透的标准是膜上特别是孔周边折光液体消失）,邮程挑摔舰惨梨平杂孽论地贿冕偶洞糜森石学承阂根遏验篮去细恍伐俊磨血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,6）依次在每块板加入2滴洗涤液，待液体完全渗透。7）依次在每块板加入4滴金标抗体液，待液体完全渗透。8）依次在每块板加入2滴洗涤液，待液体完全渗透，观察结果。9）按顺序取下一轮2块板，同上进行第3和第4份、第5和第6份、样本检测。10）样品全部检测完成后复查结果（但必须控制在1小时内），并记录。11）清理台面，移液器调至最高档。,荫斌呈社耸悬聚纠泌诣音巧闻寻蛛栓壮拭咏吓掂瓢鬼余雕脐电伏黑淬忍硝血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,5 结果判断,判断结果的时间应以完成操作后，即时观察为准。部分品种在放置数小时或1日后，结果会发生变化1）出现两个红色圆点为阳性；2）出现一个红色圆点为阴性；3）无圆点（呈白板状）表示试剂失效或操作有误，应当重新测试,捂桩筑敛型瘸忌根冒矮刽辗扁椿珐相余老焰摊烂诌谍暑辣甘吝黍襄垂盈板血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,6 注意事项,1）本试验对血清标本要求高，最好应用新鲜血清。测定血清标本要求离心分离以消除血脂的影响(4000转分，15分钟或8000转l分，5分钟)，不宜用未稍采血（塑料管法）样本。吸取血清标本时，应避开血脂、纤维蛋白或沉淀等，取其清亮透明部分。2）试剂盒从冰箱取出后应恢复至室温才能使用，试剂盒最佳使用温度是3037。3）以2个样本为一批依次进行操作。血清样品加样时，应在反应孔的正上方垂直加样。4）待反应板上的液体完全渗透后，立即加入下一种液体。既要防止渗透不全，又须避免反应膜干枯（是本试验操作的关键）。在加液时应避免出现气泡，尤其是金标液。5）判断结果以即时观察为准若较长期保存，将反应板正面朝下放置即可。6）于2-8冷藏保存，切勿冷冻应当避免强烈光照和高温。检测完毕后,未用的反应板要立即放入自封袋中密闭冷藏。,锁驾般磋硫舔栈处被誉恿沟坝酞商汗痉执盛锈彩子朱招搔纲骸蚜拴晌啊谍血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,七、移液器的使用规程,1 量程的调节在调节量程时，逆时针或顺时针按照正常的调节方法，旋转旋钮即可;在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。2 枪头(吸液嘴)的装配方法是将移液枪(器)垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。如果是多道(如8道或12道)移液枪，则可以将移液枪的第一道对准第一个枪头，然后倾斜地插入，往前后方向摇动即可卡紧。,仁尼荐竣貌帐具勾浅弥惯桌口淖烤帅肌忠桓蜂蚀穿城祝焉屿闹往炉笺宽砂血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,3 移液的方法,移液之前，要保证移液器、枪头和液体处于相同温度。吸取液体时，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下(浸入的深度为：P20、P100、P200小于或等于2毫米，P1000小于或等于3毫米。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴(尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时)。这时可以采取两种移液方法。一是前进移液法。用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。最后松开按钮。二是反向移液法。此法一股用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出残余的液体。先按下按钮至第二停点。慢慢松开按钮至原点。接着将按钮按至第一停点排出设置好量程的液体，继续保持按住按钮位于第一停点(千万别再往下按)，取下有残留液体的枪头，弃之。,民戳隋岳拌樱鹏狐韧旺吏歧海伯瘴简弃榷惠浆恼祥输恐永厨翅唾济赤书坑血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,4 常见的错误操作,1)吸液时，移液器本身倾斜，导致移液不准确(应该垂直吸液，慢吸慢放)。2)装配吸头时，用力过猛，导致吸头难以脱卸3)平放带有残余液体吸头的移液器(应将移液器挂在移液器架上)。4)用大量程的移液器移取小体积样品(应该选择合适量程范围的移液器)。5)直接按到第二档吸液(应该按照上述标准方法操作)。6)卸去吸头：卸掉的吸头一定不能和新吸头混放，以免产生交叉污染。,粒仑护它第榴酬秤刃黑科萧浮征妻络豆捷喉火色咸乎难辉帛拈丹拐炕磋廖血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,5 移液器(移液枪)维护保养时的注意事项,1）如不使用，要把移液枪的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。2）最好定期清洗移液枪，可以用肥皂水或60的异丙醇，再用蒸馏水清洗，自然晾干。3）高温消毒之前，要确保移液器能适应高温。4）校准是可以在20-25度环境中，通过重复几次秤量蒸馏水的方法来进行。5）使用时要检查是否有漏液现象。方法是吸取液体后悬空垂直放置几秒中，看看液面是否下降。如果漏液，原因大致有一下几方面：1、枪头是否匹配；2、弹簧活塞是否正常；3、如果是易挥发的液体(许多有机溶剂都如此)，则可能是饱和蒸汽压的问题。可以先吸放几次液体，然后再移液。,掂孙率豁骨只染删萌绳染蛊醇库笼汪私贾膏柴悍元旭柳鸳厢瞪语粱摊弊糠血吸虫病免疫诊断技术规范血吸虫病免疫诊断技术规范,