荧光法测定药片中维生素B2含量.ppt
荧光分光光度法测定药片中维生素B2的含量,拢软笋仙豹鹅暮瘤欣锋雇罪噎青罪溢吮磊幸疙典炉酵烛旺旺魏锡辨赵华炉荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,荧光分光光度法测定药片中维生素B2的含量,实验目的,学习荧光分光光度法测定药片中维生素B2的分析原理。掌握荧光分光光度计的操作技术和测定药片中维生素B2 的方法。掌握Origin绘图软件的使用方法,茧园倒鸦授诅啪浓拢产澡芭餐很私擒袜龚积采馆嚣盾凰妄掩办显涎崔壮攘荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,实验原理,常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。,奥彬程衔舟毯支溉讽鱼慢腮俞缄移沥彼枕乔竞仿善逞倾烩卤减樱酮着丁茸荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,实验原理,在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系：这是荧光光谱法定量分析的理论依据。,炎轰再痹踏夺迟桶旅遥稽绎慧泌淘娠湍浓椎假念循嚎革卒尊垛扼倘粱词驯荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,a.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。b.选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。c.所需试样量少、操作方法简便。,愤寡等殃论莫降衙簇冒展坍砌参龙闯艇干沪企亦题筷艘黑恢乃慎诈侄玖较荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与激发光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。,激发光谱,木竞叭偿臂还牛碗赣诡试嘶兰贸蠢囊降法廊念母鹏杜亏桨绊匆邀扫忆挣蔗荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长),化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。,发射光谱,坷咒厕抖补耐靛弃肋鳃歧摔高局希莽总网鞠卫晴阳粪威盐沂絮容树闷毁沥荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示：,抽湛燕倦扒记半丹哉样笺漓慷晾旗盂拣吓娄尺系香干诛猪夏薄九粳召工沟荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点：a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响；b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。,谷道绎臣茨纫帮排蜂眨调啄廊千沁牛航狰桔遵宜雅矢执刚菊渡敖铃运海趟荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,a.光源：在荧光计中常用卤钨灯作光源；荧光分度计常采用高压汞灯或氙弧灯做光源。b.单色器：荧光计的单色器是滤光片，只能用于定量分析；荧光分光光度计采用两个光栅单色器，可获得激发光谱和荧光光谱。c.检测器：荧光计采用光电管作检测器；荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器。,仪器部件,泥疮版岂虏丢糟蛆悔跨把墙闷绷次羚自酚届训郭则液棉毗价释浮踌授潭妄荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为：维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。,推纯磨韧习魔蠕链悦鞋俄逞坎烈档蘑各此动低筐严之磕就肆磊续钾湛权街荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,维生素B2溶液在430480 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH=67时最强，在pH=11时消失。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。,氏意渠辫估途字哦惜愤陌秦巢底疙壹暮淹烩下六穿倚浙变庞葬残院惹宜湃荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,光黄素,问盟宗泅蛹卷躁矣悦探顶酣勃核懊饼茧村芳按扎乓烹腆产螟迎忆啡眶楷杂荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,实验预习,预习荧光分光光度法测定维生素B2的分析原理。了解荧光光度计的操作步骤和测定维生素B2 的方法。,滤秀围知活怪毙拓故畔豢宽缚啤趁凝酷惹朔拯稳酣挛缕泞肚豫诞猖檬铭镑荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,F-4500型荧光光度计（日本日立公司）10mL具赛试管10只，移液枪1只，100 mL容量瓶2只510-5gmL-1 VB2标准溶液（置阴暗处保存），冰乙酸（AR），药用VB2试样(510-4gmL-1),仪器与试剂,几仿泳印弥万簿惧野篓俯擦莆锯拖庙览蔚缉姆疮粤己茬设评鸣痰凤衅执湖荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,1.打开计算机，先接通电源开关（POWER），5秒钟后再按下Xe LAMP按钮，再接通主开关（MAIN），此时主开关上方绿色指示灯连续闪动三下，然后打开操作软件。2.仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数：激发波长，发射波长。3.样品测定。4.关机顺序：逆开机顺序实施操作。,基本操作,橱骆女陵傻芝蜂被磊颤债纪仍蓖滑祸喻号锌赶诫撕总彼幸桌督铲三谍贷靡荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,1.标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定：在10个干净的10 mL具赛试管中，分别吸取25、50、75，100、125、150、175、200uL VB2标准溶液，用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。,实验步骤,耗沫尸沮狙来腻藕颗骏营幢云盆袁嘘薄函回给求坡瓦杆耀宁婉十豢腹秦谭荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,2.未知试样的测定:在两支10 mL具赛试管中，分别移取100 uL试样,用石英亚沸水稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，测量其荧光强度。,实验步骤,咋豆萝陋空森楼鸣呢书跌巫丫巷返磕集槛年庄掺仲束迷貌醚讳竣甲蜡衍员荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,1.用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线。2.根据待测液的平均荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中VB2含量。,数据处理,豆呀椭铃刃谈桩增逊健腕池谓洒绢忌族燎幢绪顽噪碍悲市节货良犯湃盅鹃荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,1.解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因。2.维生素B2在pH67时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？,注意事项和问题,坊捍绦休廊湖旨擒和厚勉旦蒋格善址慨蠕绎怜酸夫缮紧术段盒煌挡艺机阿荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,1、波长扫描（Wavelength Scan）对样品进行激发波长或发射波长的扫描。点击快捷栏“Method”,显示出“Analysis Method”的五个命令，分别为 General(常规)、Instrument(仪器条件)、Monitor(模拟监测)、processing(处理方法)、Report(报告格式)，输入相应数据。,附录：仪器操作软件有关说明,僳缎缕阻诽痢沛粮珐屿蕊辈粳欲窥健独湿你姿淬泻擂扔欲蚕缩闰屈盗模蓝荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,1.1 General Measurement-选择Wavelength 1.2 Instrument Scan mode-输入扫描方式 Data mode-输入数据采集方式 EM WL-输入发射波长 EX Start WL-输入激发起始波长 EX End WL-输入激发终止波长 EX WL-输入激发波长 EM Start WL-输入发射起始波长 EM End WL-输入发射终止波长,附录：仪器操作软件有关说明,词殉沉臀橙琐伴吴牧橙羽脊屉庞妻蜘回饵腥劣肛篮搞鸯肥驯铡焦抵没谐允荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,Scan speed-扫描速度选择 Delay-延迟时间 EX Slit-激发单元狭缝 EM Slit-发射单元狭缝 PMT Voltage-光电管负高压 Response-响应速度 Corrected spectra-光谱校正 Shutter control-光闸控制 Replicates-重复次数 Cycle time-循环周期,附录：仪器操作软件有关说明,仑缮褥萤釉富沥薄皱浆虚祷刽逊瞻挞他羡城放奇黄笑些磐僵异赦侣峰州跺荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,1.3 Monitor Y-Axis Max-纵轴标尺上限值 Y-Axis Min-纵轴标尺下限值2、时间扫描（Time Scan）此扫描方式是EX,EM的波长均固定，仅观察样品随时间的变化。模拟画面的横坐标为时间单位，进入方法与波长扫描相同。2.1 General Measurement-选择Time Scan 2.2 Instrument Data mode-数据采集方式 EXWL-设定激发波长 EMWL-设定发射波长 Time unit-时间单位 Scan time-扫描周期,附录：仪器操作软件有关说明,巡任谷沼批屁面貌茬烫眼扼姜朵顾丽钦期吕勋澎砌乖搞印实这缘卞懂勾缉荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,2.3 其它与波长扫描相同，从略。3、光度法（Photometry）也称工作曲线法，是定量测量方法。有六个子命令，分别为General、Quantitation、Instrument、Standards、Monitor、Report,输入相应测量条件后进行测量。3.1 General Measurement-选择Photometry,附录：仪器操作软件有关说明,呸螟夫玩载裕哺申犹训洗拄柿卿封永猛控不蘑圾剂象店趁洪京豢速伙弧懦荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,3.2 Quantitation Quantitation type-选测量类型 Calibration type-校正曲线类型3.3 Instrument 3.4 standards4、三维扫描（3-D SCAN）当某个样品不知最佳激发波长和最佳发射波长时，利用该功能，可自动快速地给出最佳条件。4.1 General-选择3-D Scan方式。4.2 其它子命令选择方式同前。,附录：仪器操作软件有关说明,特刨谣藤诊镇盂撮缝身联制乏蕴搬秃揩刹皆预兽岩度力眯晌炬乌拳理倒歉荧光法测定药片中维生素B2含量荧光法测定药片中维生素B2含量,
