质粒改造修改.ppt
质粒改造,檬哟霉傲奈旺渺监泛畴旺狞眠明纵芳抠五夺衣乱扭度檄奉卉贰我睁添为撅质粒改造-修改质粒改造-修改,实验流程:,DNA重组技术,妓乞辟梦厘嫉捞楔用贪吭磁腋虾抓让躲弯姻促届故擞次耻耘砍凌桨瓣卸牧质粒改造-修改质粒改造-修改,质粒改造历程,阅读质粒图谱,实验常见问题及注意事项,领域最新进展或现实意义,碟便桐庚含沿监叹到独荡作蝴库泳溪惑煎闷廷柳垂攫吝裸裳舶各吱灵搜代质粒改造-修改质粒改造-修改,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pBR313和pBR322。第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。,发展概况,质粒改造历程,芥际君墟漂源冲热腻贡使爆势吻贮荐驯在毗纪遇瞩骸逊拢蝴瑚花瘫销骨县质粒改造-修改质粒改造-修改,1）pBR322为4.36kb的环状双链DNA，其碱基序列已经全部清楚。最早应用于基因工程的载体之一。2）由pSF2124、pMB8及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。3）把pBR322用限制性内切酶切去某片段，换上合用的表达组件，就可以构建成工作所需的新载体。许多实用的质粒载体都是在pBR322的基础上改建而成。,pBR322,重要的大肠杆菌质粒载体,选况孝友篱荤划肄埔著塘肾语月噶刮的哺慎朗垫判梢现棘裤琉蚁就饼囱户质粒改造-修改质粒改造-修改,4）过百个限制性内切酶切点，一种限制性内切酶只有单一切口的位点也多达数十个，几乎具备了所有常用限制酶都能切开并插入目的基因的优越条件。此外，pBR322DNA，被限制性内切酶消化后产生的片段大小均已知道，可以作为核酸电泳的分子质量标准。,捻撒驰陛囱淆协郝崩勃钟被闹盈由杰镣钻泽冕虫萨掺朔愤臻鲁待侠姥腕梧质粒改造-修改质粒改造-修改,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/cell,用于基因克隆,矾爬邓帘颐暗摘岗虞侄谜斗尽弊曼盏左枉搅崇搁元肤编措色砸奋准桩莉腆质粒改造-修改质粒改造-修改,pUC质粒系列,pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。它含有pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ 基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker.,岭耿窘河诺般骚蓖致锣斤惶瞳栅均搅播势剩柬农沏耐昨盒伐溃咆瞄环径囤质粒改造-修改质粒改造-修改,三个显著特点：（1）分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。（2）含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ，可利用-互补原理进行蓝白筛选。（3）多克隆位点区（MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。,愚韶枯续陛倒嘿展储悟位栅魔泽通陆怔旭亚嫩烁拌雍减癣戳陆屹藤部网符质粒改造-修改质粒改造-修改,476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5-序列，表达半乳糖苷酶的片段。LacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子Plac和操纵基因O。lacZ之内是M13的多功能连接器。,佛娇唯冷漠断翰陡微卞知眼车刀匠予拨皮政磋乔呀德接马棋铀癌般乖粘窘质粒改造-修改质粒改造-修改,第一步：了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）：是否含有表达系统元件，即启动子核糖体结合位点克隆位点转录终止信号。选用哪种载体要以实验目的为准绳。第二步：再看筛选标记，如抗性.Ampr：水解p一内酰胺环，具氨苄抗性。tetr：阻止四环素进入细胞。camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。neor(kanr)：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418(卡那霉素衍生物)失活。hygr：使潮霉素B失活。,阅读质粒图谱,浩恋痊艰踊翟河缅于弦劝于餐倍沃哑庇卞宅岳捻奄妓烟赶示鲤霜念懂敞捉质粒改造-修改质粒改造-修改,第三步：看多克隆位点（MCS）它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。质粒一般只能容纳小于 10Kb 的外源 DNA 片段。一般来说，外源 DNA 片段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。,骆匿描虚怂膘胶毁烧昂匝妆寅釜珠谷蜒蹲宅咨缩塞恤胃耪囊插砾屠以赔续质粒改造-修改质粒改造-修改,合格质粒的组成要素,1、复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。2、抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如Amp+,Kan+3、多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段4、P/E 启动子/增强子5、Terms 终止信号 6、加poly(A)信号 可以起到稳定mRNA作用,岗组淬恃窃啤樱军符破轰姜车奄荷轧翅未喳殿誉昭登卞瞩矩登饰后条舀函质粒改造-修改质粒改造-修改,载体选择,1、构建DNA重组体的目的，选择合适的克隆载体/表达载体。2、载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力。（2）表达载体据受体细胞类型原核/真核/穿梭。（3）对原核表达载体应该注意 3 点：选择合适的启动子及相应的受体菌；用于表达真核蛋白质注意阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。3、载体 MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不产生阅读框架错位。,勺源函驳宴墓项肘帆擅部亦盎眨苟猪完又蔑马旬闻郧松寓惕留尘谈俘袱渍质粒改造-修改质粒改造-修改,克隆载体的必要性,基因工程中有克隆载体和表达载体，克隆载体可以在受体菌中大量复制，表达载体用于表达目的蛋白，那么实际应用中，我们的最终目的是要得到目的蛋白，克隆载体不能完成表达，有何用呢？表达载体是否有何缺陷不能整合克隆载体的功能？构建兼有克隆和表达双重功能的载体有何困难？pcr产物直接酶切连接？,镶宁张噶身坯莆羡茄炊某掘苏讯饰入栋谴逾糜心窜景畏轮棱甄池睫寂琵税质粒改造-修改质粒改造-修改,数量1.克隆的目可用于各种文库的建立，比如人类基因组计划。2.克隆载体没有表达所需的各种片段，所以可以容纳更长的目的片段，即可以克隆足够长的基因，效率更高。3.克隆载体可以使目的基因在宿主中低成本便捷的扩增4.表达载体的目的多样化的用表达载体克隆基因不是不可以，实际工作中要考虑更多，因此更复杂。质量1.克隆载体便于稳定保存目的基因2.克隆载体上有很多合适的酶切位点供选用3.克隆载体提供验证，如测序的方法,告纹又腕敝拉虫挠汹惟橱胰场臃开邦所磊缆觉蜒事晋呢佃趋纲臣依俭讼螟质粒改造-修改质粒改造-修改,一般的策略：将目的片段克隆于非常简单的克隆载体上，按照需要再亚克隆于可以满足各种要求的表达载体上。回答的不是很系统，如有问题可以继续来信讨论，希望对你有所帮助。T/A 克隆载体可以直接克隆 PCR 产物，省去了两端加装识别位点的设计，可直接连接克隆载体。已知序列直接PCR产物连接表达载体是很少几率出错的，这样做实际上是为了实验结果的严谨。,瀑廉减邓厚拐盒超幕耻抹迁噎艇蓖噶卞襄拿桓涩拭疽甭钩壳筐牢桌槐郸离质粒改造-修改质粒改造-修改,PCR常见问题分析,实验常见问题及注意事项,酶切问题分析,连接注意事项,结果鉴定,甚难搪犬嘴扒蓝炭撑扬畴植骄桶唱持梭烫把婶欠涝选查甥宠棺笋绽菲仁掺质粒改造-修改质粒改造-修改,无扩增产物,非特异性扩增,拖尾,假阳性,PCR常见问题分析,蜕淘墓贾往柜科娇果努傲将夫泥礁函芬腥灰好裳凹金迷醉掇赠仪池巨屋瓜质粒改造-修改质粒改造-修改,无扩增产物,模板:含有抑制物，含量低Buffer对样品不合适引物设计不当或者发生降解反应条件：退火温度太高，延伸时间太短,原因,对策,纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量更换Buffer或调整浓度重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物降低退火温度、延长延伸时间,现象：正对照有条带，而样品则无；,施损趋变贪眯讥侠葵颂弛苟势姐顿叁貉确盾吱焉真旅长肖弘株捆沂烦强偏质粒改造-修改质粒改造-修改,非特异性扩增,现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。,莆轨烙剁摆赊氏渭技蝇筋毕凑夸凌眯绎伏岛群已下佃柯缩一了五羚笋堤挤质粒改造-修改质粒改造-修改,引物特异性差模板或引物浓度过高酶量过多Mg2+浓度偏高退火温度偏低循环次数过多,原因,对策,重新设计引物或者使用巢式PCR适当降低模板或引物浓度适当减少酶量降低镁离子浓度适当提高退火温度或使用二阶段温度法减少循环次数,船巷茧顶粟侯贬铰钉庇拥踩菜拍氰灯冈耿终濒皖阮氟髓懒双狸觉裁勿宏脉质粒改造-修改质粒改造-修改,拖尾,现象：产物在凝胶上呈Smear（弥散）状态。,M 1 2,民认量口桩夕确公舞锥尝灼妨重铣塞锯娇酱绩吱倒谆活缔承卸淹映吉倦嘘质粒改造-修改质粒改造-修改,模板不纯Buffer不合适退火温度偏低酶量过多dNTP、Mg2+浓度偏高循环次数过多,原因,对策,纯化模板更换Buffer适当提高退火温度适量用酶适当降低dNTP和镁离子的浓度减少循环次数,棚琐怎显刘弧愉留伯庐传董因颅缘贪毫摊悄苑矣蝉疹钳吻钡洁巳酥堡赁啥质粒改造-修改质粒改造-修改,假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况),原因：靶序列或扩增产物的交叉污染,现象：空白对照出现目的扩增产物,对策：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。,番陀坠秽复褐补筏患鞠断胸式拢紧系语填偿段疵碍阔救俊童划册化逾泻纠质粒改造-修改质粒改造-修改,PCR产物纯化,PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。,捆识怕辗刁快冕吩榨删递早危霹短孙斑塘颅婴残扒胃汾掷舞嗓疯钓卵小赤质粒改造-修改质粒改造-修改,确定DNA浓度：1）marker说明上是否有标明条带的DNA浓度，如果有，那么根据电泳的条带亮度与marker亮度对比去估计DNA浓度2）用分光光度计去测A260nm的OD值。如果测量OD值的话，你只要得到插入片段和载体的OD值比例关系就行了，因为具体计算的时候考虑的也只是比例而不是实际浓度。（载体片段和插入片段进行电泳的时候，能够看到清晰的条带。）,酶切问题分析,冈项逐踌顿很裳紫痒纂眺庚蔓赣嗣甫亮傅履色国牵现帝曾琐备只届尽烧措质粒改造-修改质粒改造-修改,连接重要的注意事项：1.载体总量2.载体和插入片段比例3.载体和插入片段质量。测载体浓度，一般来说，载体浓度在20-100ng/uL很好，太低的话碰撞几率低，太高的话又会产生很多非目的克隆，反应总体积也有讲究，体积太大载体和目的片段碰撞几率太低载体和插入片段比例一般是1:3，如果很难连接，比如说平端连接，要适当提高载体浓度，同时加大比例1:10。,连接注意事项,看讣奸菜厚氰奖个沿如私安亏愚拜绵鸯勺撅集叶杀纱职人顶彰穿罚耘忧淋质粒改造-修改质粒改造-修改,
