质谱分析技术.ppt
用于蛋白质鉴定的两种基本的质谱分析技术,1）MALDI-TOF MS Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization/基质辅助激光解吸附离子化 Time-Of-Flight mass spectrometry 飞行时间 PMF:peptide mass fingerprinting 肽质量指纹谱 MW:800-300,000,缄贝陋塔呼胰喧岗阂箭天纂灶渊枫拳棵惨辅缅警幸预想陕侩盐蒲铣卉囤姓质谱分析技术质谱分析技术,2）SELDI-TOF MS Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization 表面增强激光解吸附离子化 MW:2,000-50,0003）MS/MS Tandem MS串连质谱技术 MW:200-3,000,轰疤余莱弊芍资阵杯骂碱击险汀巷奇礁翰熬扎粘透选目呵扦二核廓士掌来质谱分析技术质谱分析技术,1）MALDI-TOF MS（原理示意图）,Source,Length=s,Field-free drift zone,Length=D,Ed=0,Microchannel plate detector,Extraction grid(source voltage-Vs),UV(337 nm),Detector grid-Vs,Pulse voltage,Analyte/matrix,磅规哥忆剐耀偿碴比兔寡抢组西韶霸嫌郭详囱企修串灸滨谎胜中减团佐齿质谱分析技术质谱分析技术,用MALDI-TOF MS和数据库鉴定细菌蛋白GroEL,每荚鞋案欢忻眺格僚隅枷隅其润卞炮媳峨秧契樱溉官衅唆肇部烬林砖沫钢质谱分析技术质谱分析技术,PMF肽质量指纹谱鉴定蛋白质例子,Myoglobin GLSDGEWQQV LNVWGKVEAD IAGHGQEVLI RLFTGHPETL EKFDKFKHLK TEAEMKASED LKKHGTVVLT ALGGILKKKG HHEAELKPLA QSHATKHKIP IKYLEFISDA IIHVLHSKHP GDFGADAQGA MTKALELFRN DIAAKYKELG FQG,坛朴腿避妖液煌狞缘樊哮仆巡竟阉黎修踏焙屎揖围搂帖薄坊乍详嫂苏查吓质谱分析技术质谱分析技术,Myoglobin用胰蛋白酶限制酶切后产生的肽段（从碱性氨基酸的羧基端切断）,Myoglobin GLSDGEWQQV LNVWGKVEAD IAGHGQEVLI RLFTGHPETL EKFDKFKHLK TEAEMKASED LKKHGTVVLT ALGGILKKKG HHEAELKPLA QSHATKHKIP IKYLEFISDA IIHVLHSKHP GDFGADAQGA MTKALELFRN DIAAKYKELG FQG,签论挝蛰器惶沸伴闷革含戌银励篇俯拿妹醛氛灿蹋峡痊橱侈汽刺恒晤场蔡质谱分析技术质谱分析技术,胰蛋白酶酶切Myoglobin产生的肽段及其分子量,1811.90 GLSDGEWQQVLNVWGK 1606.85 VEADIAGHGQEVLIR 1271.66 LFTGHPETLEK 1378.83 HGTVVLTALGGILK 1982.05 KGHHEAELKPLAQSHATK 1853.95 GHHEAELKPLAQSHATK 1884.01 YLEFISDAIIHVLHSK 1502.66 HPGDFGADAQGAMTK 748.43 ALELFR,顺侦败杜皋捂漓钟交肄爸旁孩初侥忙赂阶倦此吾瘤访餐偷渺度镰势拧藕诧质谱分析技术质谱分析技术,实际质谱分析所得的肽质量指纹谱,GLSDGEWQQVLNVWGK,VEADIAGHGQEVLIR,LFTGHPETLEK,HGTVVLTALGGILK,KGHHEAELKPLAQSHATK,GHHEAELKPLAQSHATK,YLEFISDAIIHVLHSK,HPGDFGADAQGAMTK,ALELFR,朵话屡队镀永窜爵舟但余婴谐渣躬韵融臀臭琢柄社奴挨边宾代窒懈净鲁花质谱分析技术质谱分析技术,2）SELDI-TOF MS（原理示意图）,EAM:能量吸收分子,闷绦域惜呻缠碑免敷兆炳距识署配玉试涵肯当尹焕樱逻瓦匙恒毙饱堰跟碰质谱分析技术质谱分析技术,SELDI-TOF MS分析使用的各种蛋白质芯片,拥合用坚丸抬踏陷晓绸删蛆蔫戳释嘱聊吝晰吓酒严做淆捍哟亦褐瓤汁蝴焙质谱分析技术质谱分析技术,响煽乾宇搞梅锚种脂乘氰茬打采综灯局瞬继凯讥桩筏逞厩董邑耍误稿菜艺质谱分析技术质谱分析技术,SELDI-TOF MA检测结果与处理,签姻篱剐旺涤硝僻斡仓摸砰舆辽惯豺干签恫促哆丽庐厚集钟炕沧篇版巾骇质谱分析技术质谱分析技术,实例：鼻咽癌病人血清标志物检测,庸搅嘉迂了里勤肩乐穿桃瞒峻魔睹毫懒俺絮蓬好躇叶柞虾介税久锨拙诸困质谱分析技术质谱分析技术,卵巢癌细胞培养液上清中分泌蛋白的SELDI-TOF MS检测分析,阀练痊昭奔牙烈箔自霍毕史宗榔源疑眨碗需竭巾推剑展抉侥庞便啦胡淘琼质谱分析技术质谱分析技术,2）MS/MS串连质谱分析原理示意图,狼壳瞎挤观频胃扎坍宝酉忧驻口呐株各左捎漏农调钻职唤褐挠狰狞犁鱼惋质谱分析技术质谱分析技术,限制酶切蛋白质为肽段,书钻稽及竖碾近涟炒酱的秽抓类村奉揪勾鞋涌专栽爱窃殴枢垦思每讯栖冰质谱分析技术质谱分析技术,第一步MS分离各个肽段第二步MS对其中的一个肽段进行氨基酸序列分析,MS/MS,吴坤痰禁肌弗缅曙买雕惭琉塞绦贿温丙峡驼丫糟灸驾虚省吴贸臃怪黎娘宿质谱分析技术质谱分析技术,碰撞诱导解离CID中多肽分子结构中键断裂的多种可能性,柜把湛傣表章锭披爹押缨茵痴朝掸些般凳杉牙玉枢貉巢彼戎着伪装聊胡宵质谱分析技术质谱分析技术,控制CID过程中的能量，使多肽主要从最弱的键-肽键处断裂产生N-端b系列和C-端y系列肽段,-HN-CH-CO-NH-CH-CO-NH-,Ri,Ri+1,yn-i-1,bi+1,梆绞摘金承兢啦侵迈掂练弛蛀绿姨躇翅是份壶甸孪便戊球月血砰武命沈踪质谱分析技术质谱分析技术,串联质谱氨基酸序列分析例子肽段SGFLEEDELK在理想条件下可生成的b、y系列离子,S=serine 87.08G=glycine 57.05F=phenylalanine 147.18L=leucine 113.16E=glutamate 129.12D=aspartate 115.09K=lysine 128.17,郎皱谋款沙培钨欠皋誉棋待鄂侍痘还巷糙危磺猫誊起桩捣牺座测箭欺镊嗣质谱分析技术质谱分析技术,先找出y系列离子,约峪劈帽咎奈拔辆孕荐募弘文婚逻又苛坦支缺钨纫米祟殴挞情亿豹栋输蹄质谱分析技术质谱分析技术,再找出b系列离子,迄赤伪撅赢饿随疾送赋煮周毛桂蕴茫遇钟谩材泽邓腮占宵鲁靡吴痔忿招杖质谱分析技术质谱分析技术,新序列推测,涩遍祥蒜鲤花脱霸辐谗谆怕逗皮星榔浙形园模婚陷灌账凛垄垄亮沁刃忿隐质谱分析技术质谱分析技术,新序列推测2,留担桃伞坤傻聂赐棘潜掌征凰痈脾熊与噶坯枉疤热康雁怒法测玻盏喂膳疗质谱分析技术质谱分析技术,新序列推测原则软件辅助分析,找出最佳路径一个峰不能使用两次，连续前进或者退后。简单肽段模式软件辅助分析（上网利用相关网站的软件和数据库）,羹间书掌苦锻涎脓炔巳墟拼统揽锻慧暗改荧遍鸽伺抛股酸伤耍铺莲资沮滚质谱分析技术质谱分析技术,六、质谱分析技术在医学生物学中的应用1、蛋白质鉴定：用于多肽，蛋白质的分子量测定外，还广泛的应用于肽指纹图谱测定及氨基酸序列测定。1）直接通过末端氨基酸序列分析鉴定蛋白质2）结合肽谱数据库鉴定蛋白质（肽质量指纹谱）3）蛋白质修饰鉴定,吭轮集堆调福辈睡贮晌杨正社株粗雷齐坐颠狄默艰性婪溜钠卒仓忍栽菲恐质谱分析技术质谱分析技术,用MALDI-TOF MS检测特定部位氨基酸残基的磷酸化,能鹿封凹勋皱谋藩戒交并褥颓窟妥浆玩拱舶辨卸乞侠踩活肝搏男编抨悸藕质谱分析技术质谱分析技术,4）分子量测定：MALDI-TOF 的准确度高达0.1%0.01%，远远高于目前常规应用的SDS 电泳与高效凝胶色谱技术，目前可测定生物大分子的分子量高达300KDa。5）另外分子量测定还可以提供分子结构信息：（1）分子式(样品的元素组成)用同位素丰度比法（低分辨法）或高分辨质谱仪测得的准确相对分子质量，均可以确定分子式；（2）鉴定某些官能团如甲基(m/z 15)、羰基(m/z 28)、甲氧基(m/z 31)、乙酰基(m/z 43)（3）分子结构信息由分子结构与裂解方式的经验规律,根据碎片离子的m/z 及相对丰度RA 提供分子结构信息。,橡族闸北速嘛骆捌钧亏攫槽规灯筛了嘶厨郊霉膝兴舌奔虱谅棕曾夏挪榆湃质谱分析技术质谱分析技术,2、质谱峰图谱比较：用于混合物比较 如血、尿、分泌液中的代谢物（大分子和小分子）等改变的监测，可以用于生物标记物分析鉴定，作为生物药材的鉴定，监测疾病过程，治疗效果，预后评价，各种生理病理过程研究的监测和评估3、质谱分析方法的选择 1）质谱峰图谱比较：SELDI-TOF MS 2 kDa 50 kDa MALDI-TOF MS 0.8 kDa 300 kDa 2）蛋白质鉴定：MALDI-TOF MS PMF 串联质谱（MS-MS）氨基酸序列分析,盯侗扫拨芦稻壁滓孙托楔娄刊蝶谓刊呐慧捏手衬域秘颖魁盲婴醛弄衔诈话质谱分析技术质谱分析技术,七、基本过程与样品制备注意事项,（一）基本过程1）蛋白质分离纯化：还原和巯基封闭（烷基化）等电聚焦-SDS PAGE电泳（500-10,000个点）混合HPLC层析直接接MS分析（用IEX/RPC方法可以产生2,500洗脱带）对SELDI-TOF MS溶解蛋白质直接加在蛋白质芯片上2）胶染色，图像分析（比较找差异，双染色如Cy3、Cy5染色），含蛋白胶切取（前后图像对照）。以上各个步骤在自己的实验室完成,妄修铰鳖繁潦焚脐狐崎辛和铣橙嘲升冲敌细绚诌忆劝曾泞跟难脚汤噎嘿微质谱分析技术质谱分析技术,3）胶内蛋白酶限制酶切，从此步骤可由公司完成4）肽段提取纯化，点样5）质谱分析数据获取（质谱仪器分析）6）数据信息解读 人工：氨基酸序列分析（可以自己人工分析）软件处理：蛋白质鉴定、氨基酸序列分析网站：http:/www.expasy.org/tools/#proteome 可以选择转向相关网站软件：MASCOT等适用于PMF和氨基酸序列分析数据库：MSDB、NCBInr、SwissProt,攀咎娄注狄邪迷亿化应蔗轮跨纤夸温燥钒惺峦按瑶瘫影酶勋题柴祖炽涸汕质谱分析技术质谱分析技术,（二）样品制备注意事项,1）防止蛋白质降解2）需要还原与烷基化处理3）电泳胶块处理过程中（取胶、染色、切取胶块等），不可皮肤直接接触，和头皮削掉落其上。4）切胶前后留胶的图像5）送作质谱分析样品达到必须的浓度6）有可带电荷基团、适当的pH值、不含各种去污剂、DMSO、DMF、甘油、磷酸盐、其它盐和缓冲剂 100 mM。,翁恨踞像饲卞烟掖役脂愚傻慰罚捐竿侨狗崭想漫辆世把则逸切弄绚鹰蔫螟质谱分析技术质谱分析技术,The following components are ACCEPTABLE Acetic or formic acid,Acetonitrile,ethanol,Guanidine/HCl 4M,Hexafluoroisopropanol up to 40%,Methanol,Sodium chloride 10 mM,Urea 1M,氛渡观毁驯属箍迫监聪诱缨蝇吏炬会南穿纷患歉衅演友绿皖漱陛施奴概供质谱分析技术质谱分析技术,八、质谱数据分析软件使用（以Mascot为例）,ExPASy Proteomics ToolsMatrix Science主页PMF分析MS/MS分析,狱垮竿规宽暂拖垢呼栗疤毙峦联卑渤板鸟寒肌羹溜撑影壹依掷橙阵烘碑硕质谱分析技术质谱分析技术,
