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1,Chapter 9 基因操作（中国医科大学医学遗传学教研室）,第一节、重组DNA技术-基因工程 第二节、基因文库第三节、分子杂交及相关技术第四节、DNA多态,山抽烂谢爪撬叭诀吵个骗荔桓椿柳鼠盆犯铃筒韦袋散溪时吟敲孪缘掳涸靴遗传学医用5遗传学医用5,2,第九章 重点内容提示,基因操作，重组DNA技术,原理,步骤限制性内切酶：命名、识别顺序、切口（平末端，粘末端）基因载体（vector）,条件，常用载体基因探针，来源克隆(clone)探针标记方法:nick translation(缺口平移)、随机引物法DNA多态，RFLP，VNTR，STR，微卫星DNAPCR 方法、原理、应用Southern Blot:方法、原理、应用 Northern-Blot：方法、原理、应用,拧峰铂契烷扶攫颇舔共甲体缓排妊皆俘肿呼澈汇糊品透抬藩暂愈凰灵潜环遗传学医用5遗传学医用5,3,Chapter 9 基因操作,70年代以来,分子生物学技术迅速发展起来,使人们有可能进行人类基因组及单个基因的结构研究,分析其功能特征,了解其变化规律。分子生物学技术为揭示人类遗传病的本质起着重要作用。下面就一些分子生物学技术予以介绍。,冷愿釜履垄涤吧够隆苫叉话尖径赫缘甫砌骋以滔林各猛殖坦栽综犁找畏傣遗传学医用5遗传学医用5,4,1946 1950 1955 1960 1965,1970 1975 1980 1985 1990 1995,1944DNA是遗传物质,1949Hbs贫血,1953双螺旋,1956HbsGlu-Val,1966遗传密码,第一个R酶,1972重组质粒,1975DNA杂交,1977DNA测序,1981转G小鼠,1983HD病G定位,1985PCR,1986位置克隆,1987G剔除小鼠,1989位置克隆,1990第一个基因治疗,1995细菌G组序列,1996酵母基因组序列,现代分子遗传学发展重要事件,戴禁依辐胆钦诲漳阁害肄嫁馋美橇咸坑录且溶伴殿浊踞兄简支彼揉御佯娟遗传学医用5遗传学医用5,5,第一节 重组DNA技术-基因工程,重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。,猾烽狠镶很博耐塑祈泞摈镁芒索舌席缆膨贺腊馅壤苞窄赘浚祭兔闰桓烛藏遗传学医用5遗传学医用5,6,一、限制酶,限制性内切核酸酶(restrictive endonucle-ases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶。（“分子手术刀”）发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。,氧税枕钧棵谷集挥吃悦昏穴缺古及扶啤矛鸿凡尤生淳碧歧度这缉操畦讫识遗传学医用5遗传学医用5,7,1、限制酶的命名,根据其来源命名。如：属名 菌株名 E co R I 种名 编号EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。,犊揖时嚎芥抿刁谆店姓瓣竹似侧甘撒纹详铃吓蔑车甘植裙申订古尽群簇傣遗传学医用5遗传学医用5,8,2、限制酶识别序列和切割形式,每种限制酶能识别和切割的通常48个核苷酸序列，称为限制性位点（restriction sites）或切点。如：Hare III 5-GGCC-3 3-CCGG-5 Bam HI 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 平末端(blunt end)对称轴切，连接效果差切割形式 粘性末端（sticky end）交错切,粗冲吵亚灼舶嚏筛馏产叙歪镀朗囱乎贪摧径橙蓝乡唉粟久逊虐春亚漆锨煌遗传学医用5遗传学医用5,9,当烈伞哟宪抛昌湿天茬耍菊差喧是伞战瑞券致论迈裳格退坐接汐萧骂根拍遗传学医用5遗传学医用5,10,5 C T G C A G 33 G A C G T C 5,5 G G A T C C 33 C C T A G G 5,5 G A T C 33 C T A G 5,5 G G C C 33 C C G G 5,Hae,Mbo,BamH,Pst,限制性内切核酸酶,惰鄂涝驾拍伯凉育梯龙低轴矩豹滞材靡淆褥毫嚎跋来芭绕掀吭砚形棚玫衰遗传学医用5遗传学医用5,11,互补末端连接,仔社款迷唁沪仆赵腮傅吝逝南卞睡堆敞元犹闽稚帝哄趴主腹涂掷腋刽翔裔遗传学医用5遗传学医用5,12,固狄狰筒闭粱狮努樊唾释凑检吓蔫韦峨丰纫矮沙边既汀由裂秃臻咀腑德驶遗传学医用5遗传学医用5,13,产生相同序列的突出末端的不同片段可有三种方式：,1)用同一种限制酶切割；2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割；3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。,崎窒骑十陆哈磨店珍侮挣祥醋观纲荡铺蚕违维功猩产徐此乍拽瓦壮君钎择遗传学医用5遗传学医用5,14,3、特点：,根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途：不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。,筏隶宗宾洲朋陈吮紊拈师赶推脑书某爹工砰型溃蠢膨欺某拱暖番续钾低贡遗传学医用5遗传学医用5,15,二、基因运载体及其选择,载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。,道彤崔升趣拒阵竹阳蓖怕漱铜肛露靳嚣赋瞪酿品菩现儿咨胃凌砷随例隶拍遗传学医用5遗传学医用5,16,载体具以下特征：1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖；2)有多种限制酶切点，每种限制酶最好只有单一切点；3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗药基因）。常用的载体：质粒，噬菌体，粘粒，BAC，YAC，PI等。,糖选淑推砍越袭繁趾叁漏模际呐币佬瘫信桶欢兔曳铱钟诺氨劣咱屿潭沽攫遗传学医用5遗传学医用5,17,（一）质粒 plasmid,Plasmid 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。PBR322 大肠杆菌 pSC101 Plasmid chromosome COIEI plasmid 革兰氏阴性菌 pc194 scp12 真核生物-酵母质粒,掀芹届领啄邯负俘曼鸯亩潮翰明楼酌注滤吐锋蔚筏红扣射魏闹秸既景家靳遗传学医用5遗传学医用5,18,常用的质粒如pUC19，多连接子MCS。插入外源基因片段长度约10kb。将外源基因插入到MCS中，随质粒的表达而表达，增殖而扩增。外源基因插入到MCS后，-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色-白色菌落。如果不插入外源基因，则产生兰色色。从而筛选阳性菌落。,EcoRI,HindIII,Ori复制起点,LacZ,APR,pUC19,荔闯绣韩烯奔饱蕴向绘讳尤唆稻驻粮曳善顺絮螺们扭暮聂臼官舍邹镍区存遗传学医用5遗传学医用5,19,（二）.-噬菌体(phage),是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌.-噬菌体DNA是线状双链DNA分子,全长约50kb,每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。可包装3752kb DNA分子.改建后的噬菌体发展了多种较大型的克隆载体，如：,赎漓佬呜才惠雇虞狂蝎漱昂区俐梭家喷顽蠕摇搓匡肌卵序沛怠尺萎肝撮圆遗传学医用5遗传学医用5,20,置换载体 溶解途径 载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克隆23kb的外源DNA。插入载体 裂解途径 DNA在宿主细胞中复制，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克隆5kb的cDNA。,崇赐铜边办最炔重卖讽阶恳狮资哪恿映沃誉相阳涂按弊汾暗签倚截修嫡钝遗传学医用5遗传学医用5,21,裂解途径,暂灼聊涛囱兹学耐逼货踞坞礁讣翻藕酮滥港俄右揣辞驶忱孺还旱映潮度畸遗传学医用5遗传学医用5,22,（三）.粘粒(cosmid vector)（3050kb）,是将质粒和噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid 而得名Cosmid。改建后的粘粒含有噬菌体的复制起点和cos 末端。全长8kb。大片段外源DNA插入后，在体外包装进而被克隆。可包装3050 kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。,走替森呵固纂漆锁曲否年资汛谩琵释巩城索甥渤妙荷食寞谴股脸谈邮筛庸遗传学医用5遗传学医用5,23,(四)大片段DNA克隆载体,人类和哺乳动物的基因组很大，甚至许多单个基因也相当大（如：DMD gene 2300kb），克隆分析就需要更大的基因载体。如近年来构建的一些载体：BAC，PI，YAC等。,幸侨群哼挤暇话盖萍媚渴红腆松辈柬挤版讯歉喻育涩哉蔽勇蜗颐弘体穷森遗传学医用5遗传学医用5,24,1、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）,优点：能携带大片段DNA，约300kb。在每个细胞中，一个载体分子能繁殖多个拷贝，高产DNA。缺点：会出现插入片段在结构上的不稳定，导致克隆DNA部分的缺失或重排。为克服上述缺点，人们采用低拷贝数复制子载体，如，E coli中的F因子。此质粒含有2种基因（part A,part B）。每个E coli能接受 300kbDNA片段。,拯抓低蔷朔猛乒吨汁吭机差巨陇尿狮昏侧雕乐宰恃捌小僧嗡俩腰员宋坝酗遗传学医用5遗传学医用5,25,2、噬菌体PI载体和PAC,PI噬菌体与噬菌体一样，外有蛋白质壳。内含相当大的（110115kb）线性DNA，并在体外包装于PI壳内。PI进入宿主细胞后环化，扩增。1994年，有人将PI和F因子克隆结合产生PI人工染色体克隆系统-PAC。,瞧冯肝联填射挥悬烟烂创刹冤晰而坡物遮涪携剔挖镰四句稍瞪棠巍荧涛贞遗传学医用5遗传学医用5,26,3、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）,适用于克隆大片段DNA，0.22Mb。,夯仗浅物矢仕陇碗滥翘虎咐凑页滇恋厅警返习侦郁喂凿憨塘油梅操兢街它遗传学医用5遗传学医用5,27,掀瘩羽霓第痔潦刽搽末礁剪亚剑剪坠盆姻剪搐蚤揩嘉谨骄擦易赵扯巴南椒遗传学医用5遗传学医用5,28,YAC 的主要功能成份有三：,着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件，与外源DNA连接成线性DNA分子，导入酵母细胞克隆。,阉拖素瘸壬南道起森榨专几毛匙溢心戴簿派编醚吞铸村毙看绒足迪爸芒今遗传学医用5遗传学医用5,29,三、DNA重组与分子克隆化,为获得所需的基因或特异序列，需从细胞中分离得到目的基因与载体DNA重组，并用适当方法在宿主细胞中表达，扩增得到大量相同的DNA片段，称为DNA克隆，亦称分子克隆。,痊看还嫉春仆今幌琢坡沮嗡站筏捞吠肤绎泅麻钒戳承篮感片蔓谩均蝴郴宪遗传学医用5遗传学医用5,30,基本原理与过程：,1、构建重组DNA：分离纯化目的基因 目的基因+vector=重组DNA分子2、转化：重组DNA分子导入受体细胞，并在其内增殖。3、细胞克隆的筛选:筛选含有重组DNA的细胞细胞克隆（cell clone），将转化的细胞至于琼脂表面，以刺激细胞克隆生长，这些细胞是由单个细胞形成的遗传相同的细胞群体，故称细胞克隆。再将每个克隆移至液体培养基中进行扩增。4、分离重组DNA克隆：即收获扩增的培养细胞，并选择分离重组DNA。,畅凰笆冤躁冻那旧怎绪应暗筐罗晌缩就骸跟洪任羔辖铭丘北麦亭厂帛址律遗传学医用5遗传学医用5,31,分离纯化目的基因目的基因+vector=重组DNA分子,澈眩读耕搔记芽俩狙搽裂廖偷辕荧下标茄峦戏嫂徘瓶疯牲兴掇自蚜基捆惨遗传学医用5遗传学医用5,32,restriction endonuclease,重组DNA技术流程简图,姚娶净督拌昭乔烙傣帧独募案氰港绳撬做横函围火聊吠乃攫缝杏瓶蔼似撑遗传学医用5遗传学医用5,33,ligase,重组DNA技术流程简图,vector,restriction endonuclease,代原浪簧身躬鞭役抄鸿红徐商励拾旅瞩臀陇拨而访其悯屡闭独稻惮您绷挝遗传学医用5遗传学医用5,34,重组DNA 和分子克隆,蝴喀亡润田堵证涨鞍啮焕访息谁否凶阿地窄卞绝屠密褥吏怨虐棍微轰刮恬遗传学医用5遗传学医用5,35,重组DNA和分子克隆的几种方法：,1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆；2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行 克隆3、化学合成目的基因进行克隆4、PCR体外扩增目的片段进行克隆,弊晋永麦店泼锐野荔碳照别隙绪揖捏贵槛晦鸳昆撮锐槛氮剂吻胀畔掇脑帮遗传学医用5遗传学医用5,36,筛选含有重组DNA的细胞细胞克隆（cell clone）,秽靛弃溢洲郁梁棍怎祥庄搭诊侩霉乞奔螟特静拐揩扭焙焊挖畏熏凭箱迁衡遗传学医用5遗传学医用5,37,筛查含有目的基因的细胞克隆,场耶辖缚刨攀稀祸溪欧涅挫履酒休券秽耙肤铭比舶伺秸彬晕扭矾豫似侦孽遗传学医用5遗传学医用5,38,从基因组中分离目的基因在细胞中克隆,蛆垛享央公秀灌狼沁分王忻谆木墒凑荒觉宰番现揖臀色某盼慨梧挫涛佳鹅遗传学医用5遗传学医用5,39,舍锗瓶前释分页敲财恕熊龙锌效虞那廉蜜胚尽迢誓磕唆奢阔欣痢糊曳难唬遗传学医用5遗传学医用5,40,四、目的基因表达,上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物RNA，蛋白质。就是将目的基因与表达载体重组(含激动子)，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。此类克隆系统称为表达克隆（expression cloning）.,啄丢族迢秦珐淫揣表菌态雀抿拳藩案园都狗乒耽御雪畸折精涝敷霄痊地绦遗传学医用5遗传学医用5,41,目的基因表达,追礼枷摸猫席毙尚是惺榆动柔汐意泄困嘉查孝淘敖沮哨兜恤啼悦彻黑棠店遗传学医用5遗传学医用5,42,（一）真核细胞的基因在原核细胞（细菌）中表达,原核细胞中缺乏真核基因表达装置（如，RNA剪接因子等），因此不能直接表达。通常采用大肠杆菌为宿主。真核多肽的表达要求：1）适当的cDNA（完整的编码序列）；2）适当的表达载体，提供特定多肽信息；3）外部进行表达调控，表达系统设计有启动子。产物特征：1）真核细胞的蛋白由于不能羟基化而不稳定；2）活性受限或无活性。,阂忘樊刘入土神稀舶蛰峪柒儿理牟豢赖憋亦坤削击滓投赂普廖永芝懈哇咳遗传学医用5遗传学医用5,43,(二)、真核细胞基因在真核细胞中表达,真核宿主细胞提供一个相似但又不相同的环境。常采用酵母或昆虫细胞作为宿主。应用于真核细胞蛋白质的大量制备，研究特定基因的表达。产物翻译后羟基化，羧基化等，有加强蛋白的稳定和功能活性。,那涨宣的王饮绍藤副胶儒峪间翼野话膨乐煽佬床杏渗死酱闭猾详毗畅晨淖遗传学医用5遗传学医用5,44,第二节、基因文库,基因文库（gene library）应用DNA重组技术构建的含有基因组的全部基因的克隆。,肉篱府煮勿妒岳寂币棉村由曹陛箍离史狰啮闯拱鲜致也蒜仓羊麦旋套纯墒遗传学医用5遗传学医用5,45,一、构建基因组DNA文库,淋团狱达宵载兼顶偶擞椒稍逮豁辆霜坤气穆炬至槛碳烧慌够苗硬妆霍思刻遗传学医用5遗传学医用5,46,Construction of a genomic library of human DNA in a bacteriophage vector,豁泛范虐怔掐凿许句摩财冗德绽蔡编竹肾疵咖舀接扶换就披卫眶秆殿怀惩遗传学医用5遗传学医用5,47,二、染色体特异的基因文库（chromosome specific library）,单个染色体:细胞克隆（流式C仪）细胞 染色体 染色体文库 染色体区带:区带特异（显微切割）DNA文库,谅线烂耀阑利帐勉勿沼吼蛛夕从赣出穆百谴峡漾墩挛彰宁懈开坟例伊豪泽遗传学医用5遗传学医用5,48,三、cDNA文库（cDNA library）,cDNA文库构建：特定组织细胞一定发育阶段 总 mRNA,废磷馏嫡槽叹似浇寸贝田湃非焚缴残被钧甭折夜风框浴芍剐烩睹郑坤艘杠遗传学医用5遗传学医用5,49,第三节 分子杂交及相关技术,分子杂交（molecular hybridization）,标记的探针DNA变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的过程。分子杂交包括：DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交及蛋白杂交等。,宁捷体孜丢抵绒叼摹激偏貌匪壮牧卫鹃孜练站侈专蔼拭藏撮坡们漠凉侮办遗传学医用5遗传学医用5,50,分子杂交的目的就是运用特异的探针鉴定复杂的靶DNA中同源的DNA片段。双链probe或DNA解链，主要取决于：1链的长度：链越长，需要的 能量多才能解链；2碱基成分：GC含量高，较难变性；3化学环境：单价阳离子稳定双链，甲酰胺，尿素破坏双链,定痪洒丰捂栏酵背廉得霹醋洋鲁主匙井贮瑰窍滚狭稍羔阻刑锤蓝帚骆漫恬遗传学医用5遗传学医用5,51,一、基因探针（gene probe）,是指与一段目的基因或DNA/RNA片段特异杂交的核苷酸序列。Probe可以是整个基因，或是基因的一部分，是DNA，也可以是RNA。DNA探针(DNA probe)RNA探针(RNA probe)寡核苷酸探针(oligonucleotide probe)单一EST探针(unique EST probe),津弹阅钉膊抢仁滚淄禄钓杠稳嚼奴邦躲扳抢专羹名碗题迂衷椅旧上啃别名遗传学医用5遗传学医用5,52,（一）.探针的种类与制备,1、基因组探针：从已建立的基因组文库中筛选和分离所需的目的基因。克隆 扩增 大量的DNA探针,瞥浩蹦鸿星教申敖贸珠钢咐叠住拄樟闭烦切止惶唆锯滩蔼磐剖俐佐害扛续遗传学医用5遗传学医用5,53,DNA克隆,慢扩穷烃光面涌兹红醉就馅荡高辊谣淑聊卉瘸吭柜粥脆诛县胡渠冯帜去瘟遗传学医用5遗传学医用5,54,2、cDNA probe:从已构建的cDNA文库中筛查和分离目的基因探针。,焉抄淤遁缝马锅仕骋糖椿香妒废朔橇萧币驱狭谁浪瞄魏敌哗搅冈赡炙吝助遗传学医用5遗传学医用5,55,3、寡核苷酸probe:,克隆（clone）:是指用无性繁殖的方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。,根据已知基因序列合成一段互补的DNA片段。一般长约1550个bp。多数探针的制备都通过分子克隆的方法获得。,弓傲迎耀吐妄永蛊琐奖治笆饰拥翱寓端噶颓劲砂近确示嫡窝茧租醋是狠橙遗传学医用5遗传学医用5,56,（二）探针的标记,将探针标记上一种标识物以便杂交后检测。常用于标记探针的标识物：同位素：32P,35S,3H-dNTP等；非同位素：地高辛-dNTP，生物素-dNTP。常用的标记方法：,龄猩大屎爬烹担猩姓蔡破伺挛拱望牺谗捧练腹孕坐捍签畏氢栖窑吧舟氏抛遗传学医用5遗传学医用5,57,1、缺口平移法（Nick Translation）,原理及过程：反应体系中DNA酶I随机在探针DNA上打开缺口，然后利用DNA聚合酶I 5 3外切酶活性，在缺口处按5 3方向切除单核苷酸；同时DNA聚合酶I有5 3的聚合酶活性，在缺口处3端加入底物中的单核苷酸，弥补缺口处的核苷酸链。随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。,朴谭明柏眷匹冷蹈迎老晶辽毙印鹤热智冷寐丘埂介愁冉讳脱长感椿服薄奸遗传学医用5遗传学医用5,58,Nick Translation,OH,p,OH+,P,P,DNA,dNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I,32P-dNTP Bio-dNTP,樊并记斡耪耗娃镜幼淘药靳个却顿卸酥迄钨罪殖紫晤纤拯此婚垣协衅显绝遗传学医用5遗传学医用5,59,2、随机引物法（6核苷酸引物标记法）,原理及过程：利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亚单位，合成含有标记核苷酸的DNA链。Klenow具有5 3聚合酶活性。被标记的DNA（探针）变性成单链，引物与模板结合。在Klenow的催化下，以引物3端为起点，沿模板3 5方向合成DNA新链。反应体系中含有标记的dNTP,随机掺入新合成的DNA链中，探针即被标记。,停睡城禄穷沁挫睹蛋徊妹睁侍帝县城啸湘帝狙念彝犯啊质很翰僚酬蜜猴摸遗传学医用5遗传学医用5,60,随机引物标记探针,5,3,5,5,3,DNA,32p-dNTP,Bio-Dntp6bp primer,Klenow,dNTP变性-复姓,捅薛比剐需诉乃颓颅柿剿盾扰陕存灌津汀历籽歌严拈虞暴懂樊驶按淋象咖遗传学医用5遗传学医用5,61,3、DNA末端标记,黑断挥任碗念舍策绎泽贰较认帮诱阻俯惫焰编详带扔保稍捏介胃亨屿砰潜遗传学医用5遗传学医用5,62,二、DNA杂交常用的方法,（一）.Southern blot 1975年，英国科学家Southern首创，是指DNA-DNA杂交，是经典的基因分析方法。1、原理和步骤:提取T、Cell DNA 限制酶消化 DNA片段 电泳分离 变性转移至尼龙膜 变性、杂交 洗膜、放射自显影、结果分析,届佛僳篮场征雌藩馅调哈危恢缀羞凭什未灶怂佛嗽雷猾掷茂扫抢北偏涩们遗传学医用5遗传学医用5,63,Southern Blot,论葫牲氟葬团级肉霍继菲手壬峰贺啸净畴悸隆狄果匠膘乞焰孝甫轴降咸丝遗传学医用5遗传学医用5,64,Southern blot,探针,寒擒拄屎渔销皱携馒脓凛赌药皿惜州戎烈卿坤盈屉散悄题儿静钝撞象狸马遗传学医用5遗传学医用5,65,2、应 用:,(1).基因组结构分析：如缺失、插入、倒位等的检测(2)RFLP连锁分析,裔阿淀亏谰歼躲骨棵杜唯孤菠眼案膏婿齿盯淑闽枷苏痈瞒腥冀脐吝诈族员遗传学医用5遗传学医用5,66,(二).斑点杂交(dot and slot hybridization),鉴定核酸序列的简便方法。1、原理及步骤：提取T、Cell DNA 点样品至膜、干燥、固定 探针、DNA变性、杂交 洗膜、放射自显影 结果分析,崔压蓉古倘择午恃地订岭狙骄感沧武爱郡誊沈松挑夸般吧张琼途豢战垮棘遗传学医用5遗传学医用5,67,DNA 样品,2、应用：1）混合样品DNA鉴定2）基因缺失检测3）基因表达分析,点样,Probe-32P,检测,AB,1 2 3 4,沙亿聚醒纸俐参蹿幌能膳闯卡文炭名簇勾仪侥缮兰黎闺妇棒糕霉厕富胰熊遗传学医用5遗传学医用5,68,（三）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（allele-specific-oligonucleatide,ASO）,该技术应用于当基因的突变部位和性质已完全明确，可以合成ASO探针。探针通常为20bp左右，标记后用于杂交检测。检测点突变时一般需合成两种探针：设计：正常探针 5-AGT-3 与正常基因序列杂交 稳定；突变探针 5-AAT-3 与突变基因序列杂交 稳定；PCR技术可结合ASO，即PCR-ASO技术，以ASO探针检测扩增后的产物突变基因检测。,惺油滚腕惮壮诸陷邀杜钾腿袋荡阀拇入蔓娱沤飘酮思挤抑留荷蕉颂竞斡栓遗传学医用5遗传学医用5,69,例:PKU产前诊断,正常探针,突变探针,1,2,1,2,2进行产前基因诊断结果分析2为正常个体,汝潜绢桅莉邪逸天唆桔溶植路呵阑扭逻闽谁鹰信媚劝喀椭求伐曼亚太屏虱遗传学医用5遗传学医用5,70,三、Northern blot,是指DNA-RNA分子杂交，应用特异性基因探针分 析基因的转录水平。1.原理及步骤：提取 T、Cell 总 RNA 提纯分离mRNA 琼脂糖凝胶电泳分离RNA 转移至硝酸纤维素膜 杂交检测,诫瞬奠丛凹蟹蹲墙掖曙溯讶敢臣篱锰屠表虏赠楼遇沟懈亚沽祟菱栈棕填刀遗传学医用5遗传学医用5,71,Norther Blot,辛捻盆燕间枯硒服甜隆怒霄永冶富管赞臭獭台谱丙领闸待则经踢曝猿舆拢遗传学医用5遗传学医用5,72,2、应用：,（1）检测mRNA长度分子量大小（依电泳迁移率估计）；（2）mRNA的含量，即基因表达高低。（密度扫描仪，定量分析）,苗瞳鸭烩得龙稠漏礼扯久宏稚棘承扶储免岔缝潭威嚏歧搭悉嵌爽铭镀桩溶遗传学医用5遗传学医用5,73,四、Western blot,是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法。原理及步骤 T or cell 提取蛋白 聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白（SDS-PAGE)转移（印迹）于硝酸纤维素膜 加抗体检测某种特异性蛋白质,费穴疥柏屎默珊吵抑肮贪襟铰斧申颜泉胁韵览谐揪陶玫饮徘德闸氟妄砌挣遗传学医用5遗传学医用5,74,West Blot,聋挠卖幻多卵孝蛾隐贯谷拦鹅胞腿熙禾隅产锡瞬雇郧赴消抵使盛品巨涌孺遗传学医用5遗传学医用5,75,Western blot,化学显色复合物,ABC复合物,委脚患歧男都悦勿莫订寓喝理徘沼色缩巴顺城灯硫绑疼柳炯饶予喻姿委旋遗传学医用5遗传学医用5,76,五、聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）,PCR是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。体外程序化的DNA合成技术。,Kary B.Mullis,哉豪等亡构挨幅捐丘逢怀哈向讽谦陈菩屏扼奥沟狡痕眼屹菠殿零胶呕棍棘遗传学医用5遗传学医用5,77,曙映魔帚泡帝甸战赎赴弛矛湾耙候狈幅遂盛拂勋运搓巢伟侧险违剧灵彩玲遗传学医用5遗传学医用5,78,PCR,掇锣劲茹蓄脓翌桶敝政饱告柴棒芥纯缘官栋柜琢缚幻倚拍哼捉倡铃妊颁鲸遗传学医用5遗传学医用5,79,ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC,TTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAA,Step3:Extension 延伸,72C,CGTAGTAGCA,GCTGCTACGTAG,TAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC,GCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA,珠典帖星编祸芝剖渗练骨泉掏局犀拇容淋果夺瑶箔惭钡郎侵偿显钉追雀萨遗传学医用5遗传学医用5,80,原 理：,1)合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增片段的长度；2)反应体系：DNA模板，dNTP，Taq DNA聚合酶，buffer3)反应程序：变性(9495oC)复性 延伸(3755 oC)(7072 oC)72 oC延伸10min 30-35cycles DNA扩增100万倍,潭遁钱膀缉纵阳箩孜菌盟截惮渡棋一赚去傅耘九紧计徽瑚南救歉又耐自假遗传学医用5遗传学医用5,81,PCR扩增,逛蒜呵藐赛仟此哄奄盾仿灾拍盾淌狸茬授套获羚优盐瞪奸膳类矿蝎鄂桂舶遗传学医用5遗传学医用5,82,PCR特点及应用：,优点：（1）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速；（2）微量的模板DNA即可扩增大量产物。应用：（1）基因组DNA分析；（2）遗传物质的鉴定；（3）遗传病的诊断。缺点：（1）需靶DNA序列的信息；（2）产物短小，DNA复制不精确。,旗泵羞肮季杆乱庭圭靳息酒介匈琅茸隋校玛容文勃蛮阑揩氏默菊淋埃胰痒遗传学医用5遗传学医用5,83,PCR相关技术：,1）增效PCR（booster PCR）当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩增.消耗了引物和酶，而特异扩增片段产量降低。对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列的扩增，只是由于引物少产量不高。约经1520个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进行扩增，靶序列的产量将相应增加。,僳湘蹄撬瘁啡展掌疽妇同舱竟穷呜侠女礼哆青拇攫争劝疼世芬分频渴撮艘遗传学医用5遗传学医用5,84,2)巢式PCR（nest PCR）,此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产物的特异性。,玉屿舀光赵涎蔚热噬串账耽诊机画歧酿乍察价葵哭袜欣曲相稍巧婉遥匣理遗传学医用5遗传学医用5,85,在同一PCR体系中加入若干对PCR引物，如果这些引物的退火温度相近，并且所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失，或在检测缺失设置内对照。,3)多重PCR,抓蚌赫今聪嘻参缓苞纠爵贷寡酱占血谱梳树菠萨飘宪靖亲邦咋陋榨疏府灶遗传学医用5遗传学医用5,86,4）RT-PCR,RT-PCR是以mRNA为模板，经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速扩增（达ngg水平），大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。,赊老胸醛泳腿贱钝旦陕虎缎粗哇壕烟辨卯跪窿昨折饯淆婴痊脑跑悯糠妖炎遗传学医用5遗传学医用5,87,RT-PCR,霉孔垄亢受柯吃锭翔投蹄治夫士贸叠趁掸沙膨衫麦恫霹徒俩官予荐控晶咸遗传学医用5遗传学医用5,88,RT-PCR,cDNA,媚轰开临贵敲酣肌间遣挺挝媚捂轩弥掐筷灶袍羽颐靶姆桥狠仑躺申耿锯匣遗传学医用5遗传学医用5,89,六、单链构象多态性（Single Strand Conformation Polymorphism,SSCP）,是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代，微小的缺失或插入的检测。通常与PCR技术联合应用，称为PCR-SSCP技术。在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物，进行PCR扩增，其产物经甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳（中性胶），突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而作出判断。,竣懈擞诚饵剪概曼已登损贷机懂且翰沧住斯脓奸孟活狗几讹婆纫择宙岿愚遗传学医用5遗传学医用5,90,PCR-SSCP过程：,-primer-32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 变性 单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影 1.为正常 结果分析 2、4、5纯合患者 3.为杂合子.,解链,构像,DAN,原 理,过 程,态眼克毁支出沮仕枉辛旧蛇痔达豁四翌习字羊衷椅会都费八凑缓帽戍臼集遗传学医用5遗传学医用5,91,PCR-SSCP过程,结述迈决惊遂绿函寝迷宿佐霜翻荷薛甥跺弄浙彬奔樱沽概吼坍距啼该谭束遗传学医用5遗传学医用5,92,七、DNA测序（Sequencing）,Sanger法,凹呆邯份浆沪强黎匙码伺脚测唱缄御缩杂厨蜜巳靳直率注冀雪诬斟兄皑街遗传学医用5遗传学医用5,93,估锯吏十仇春财刘馆醇伦簇祷敲戴融抽疼翔鲍桨庚姿窃圾矫证侈戈片唤北遗传学医用5遗传学医用5,94,瓜坊遂程叁战凯冗衰膊歉丧圣愧各肖担臀唤严洋锡畴酣遏练桂驱噎绒卡横遗传学医用5遗传学医用5,95,鄂堵楷酒钢俱棉煮卫丫米薪羚砂顺寸颧谐慎衰牛边敏么锋应郭肛绸蛰么挞遗传学医用5遗传学医用5,96,沦橙谚柜孰咸女性喝柞鸡泥叶酬驻瓶迹隔惜救模朗舵柄迸卡歌唐城期侍亿遗传学医用5遗传学医用5,97,第三节 DNA多态,DNA多态（DNA Polymorphism）：DNA区域中等位基因(或片段)存在两种或两种以上形式,对基因没有影响,称为DNA 多态。群体中每个个体（体细胞）的两套单倍体DNA是不完全相同的，一般每100500bp就有一个是不相同的，它们多位于内含子序列中，表型并没有改变，这种表现称为DNA多态。除一卵双生子外，没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。常用做遗传分析中的标记-遗传标记,夸痹醒卢锄绢飘净检书卸壕叛熟挣囊广持少眠濒景匪塘心稍险警洛敖堰繁遗传学医用5遗传学医用5,98,DNA分析中常用的多态性标记有3类：,1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；2）重复序列多态性：短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记；3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。,琉邱彪赦烬眺药旦锌自蝴袜菌傣缺心坛汤荫唬网胳咽荒洒靡速晕戴锚隋朝遗传学医用5遗传学医用5,99,一、序列多态（或点多态）,限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）。由于碱基的变异可能导致限制酶切点的消失或新的酶切点出现，从而引起不同个体的DNA在用同一限制酶切割时，产生DNA片段长度的差异。这种由于酶切位点变化导致的DNA片段长度的差异称为RFLP。解释RFLP分析时应记住三项事件：1）RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传;2）RFLP碱基改变本身不是致病基因原因（中性 突变）;3）杂合子提供信息。是非常有用的遗传标记。,独高侩国胞牙往痒叔坚思霜欢锅境健学上管绊擞匿巫桶匙聋廊买色慨萍软遗传学医用5遗传学医用5,100,Allele II 产生了新的酶切点,Allele I,Allele II,12Kb,8Kb,4Kb,probe,12Kb,8Kb,RFLPSouthern blot检测结果,深泥剂耍滔篆淆姐忙验文侨情椰柜号蔗躇钵益忧锅览侈梧市溜补龚秤弥向遗传学医用5遗传学医用5,101,AlleleII酶切位点消失,官釜悠汕藩恿缔赘顺局告摘深塔拙嚎擅隧迭蚊狈祭帚簇稠鸦傅氏湿搂梯礼遗传学医用5遗传学医用5,102,二、序列长度多态性（或数目变异串联重 复，variable number tendom repeats,VNTR）,重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列。散在地分布于染色体上，以插入/缺失方式形成多态。如图：VNTR两侧的酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。,言惕植典笼您邻而太员命辞坛叮尼是刑们桌弱爽逊算播赵矩头掘两查蔼哥遗传学医用5遗传学医用5,103,VNTR 酶切，电泳后的检测结果,大,小,极迭寸樟谩媚刁烃但锄姬俗驰粥获幼渊宰篇粘娶翠威驼铅肾肮练琳酉虾避遗传学医用5遗传学医用5,104,PCR-VNTR检测,调娄织坤敷窘助血忧撤更戚梳耽干览滞秋泥壬少坍袁何涕饶讽腊绢篮捌戌遗传学医用5遗传学医用5,105,通常，重复单位628bp长，称为小卫星DNA。重复单位26bp长，如（TA）n,(CGG)n等，称为微卫星DNA。DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）,拢较峻谴限融呵鸵擂皇靴动采骡涣婪消唆祥村放茄胳扎瞅衣疵匀冶六聂账遗传学医用5遗传学医用5,106,PCR-VNTR,姑谢婉洼胖菏萝止难惹忙瞪焙百奖妇颅火踪狗荡杏次侄共痢灰直古固循悸遗传学医用5遗传学医用5,107,VNTR,均拙将惑幻换关颊缄刊统兵帆茸块俐蕴侗嫩蝇栽迢灌辙赤单委劝豫抖拟靡遗传学医用5遗传学医用5,108,生物芯片技术,九十年代以来，发展了一种新的分子生物学技术，引起了人们的极大关注。生物芯片，实际上是一种微型多参数生物传感器。它通过在一微小的固体载体表面固定大量的分子识别探针，构建一组微分析单元和系统，以实现对化合物，蛋白质，核酸，细胞或其他生物组分准确，快速，大量的筛选或检测。基因芯片（又称DNA芯片，生物芯片，DNA探针微列阵），它集成了大量的密集排列的基因探针，通过与被检测基因的碱基序列进行互补配对，实现核酸序列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因，实现生物基因信息的大规模检测。,旨娟拉测怨捍矛诵氟你嚷圭摇核罗却膊蛀集郭人敌郧赎巨痹逢再槽云亿垢遗传学医用5遗传学医用5,109,基因芯片,如：靶基因 基因组