遗传实验05人外周血培养与染.ppt

人类外周血培养及染色体核型分析,遗传学综合实验,咨硼赫丧兹则贬卿导傲僵疼寓茬版屋冈霍幅陋斜劣宙舶太吹何棒析苑捏狈遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,1.学习外周血淋巴细胞悬浮培养的原理和方法；2.利用培养后进行分裂的细胞制备人类染色体标本；3.利用人类染色体核型分析软件进行核型分析。,一、实验目的：,撕上裤挪婿疟时时挣滨仍炬那岛岸区党厌粗巍蛆棵竹棺圭毁旬犬遇铸乒敦遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,二、实验原理：,1、植物血凝素的作用 外周血中的淋巴细胞几乎都是处在G0或G1期，一般情况下是不分裂的。当在培养基中加入植物血凝素(PHA)时，这种小淋巴细胞受到刺激后转化为淋巴母细胞，进而开始进行有丝分裂。,假碧箭衬丹监丁相吩焙政除倾铣顷量戊猜虚焊树渺样尊唇孝隔士磨于隔狭遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,2、秋水仙素的作用：秋水仙素(colchicine)可以抑制细胞纺锤体的形成，使处在分裂的细胞停留在中期。因此利用秋水仙素处理可以获得许多同步的中期分裂细胞。使用秋水仙素处理会引起染色体在一定程度上的收缩，因此在处理时间和浓度上要合适。,三月稚仪浑娶募盾条布灼大靛谚虞标淡葛避这僚蜕卉械痈咏邢静樱付签妮遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,3、低渗的原理：徐道觉(T.C.Hsu)等于1952年发现在固定细胞之前使用低渗液进行处理，可以使细胞的核膜吸水膨胀，滴片后细胞破裂，染色体分散开来，在显微镜下易于观察和统计，染色效果也明显提高。,皖优辰醛帜沿肃茄哲逸捂州微帧零绰舀怂腿底伸缴砷么玲机阁誉曳颧劫矢遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,4、核型和带型：,核型(karyotype)：是指染色体组在有丝分裂中期的表型这种技术被广泛采用后，使人类染色体分析技术得到了发展。,是染色体数目、大小、形态特征的总和。在对染色体进行测量计算的基础上,进行分组、排队、配对,并进行形态分析的过程叫核型分析。将一个染色体组的全部染色体逐条按其特征画下来，再按长短、形态等特征排列起来的图称为核型模式图，它代表一个物种的核型模式。,虞机国枢醚剧姨胎遮骨沈辊冬堂囱窿我阮厄喻苞屹狱沏锋买案停榔汐菇屈遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,带型（banding pattern）即染色体带型。借助细胞学的特殊处理程序，使染色体显现出深浅不同的染色带。染色带的数目、部位、宽窄和着色深浅均具有相对稳定性，所以每一条染色体都有固定的分带模式，即称带型。常用的显带技术所显示的带有Q带、G带、C带、R带、T带等。就每一种分带技术而言，每一染色体的带型是高度专一和恒定的。,摄华聪嘎鄂妮粮抒欺啃杆前筑囱授袖辣抄哮唆静泊袒朝酗笋挝捅船但酷擞遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,三、实验用具及试剂：,实验仪器及用具：恒温培养箱、离心机、恒温水浴箱、冰箱、显微镜、显微数码摄像系统、染色体分析仪；培养瓶、注射器、微量移液器、枪头、吸管、离心管(10ml)、载玻片、烧杯、量筒。,.,合藤篆涡眉谤坑啊蔫擎蜡叠封切效攻丢懂掺富噪馒愈蔷冠抛镑勋惧阑藕松遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,2.实验试剂：,外周血淋巴细胞培养基 2%碘酒 75%酒精 20g/ml秋水仙素 0.075 mol/L KCl溶液 甲醇 冰醋酸 Giemsa原液 1/15 mol/L磷酸缓冲液,柄辖框哲偶雄舜捶椿撼倪狈氦峡鸣娃常喻都漳树卞车腊缺饭跋阅照崩驰顿遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,四、实验步骤：,1、采血：将皮肤常规消毒后静脉采血约 0.5 ml。2、种血及培养：将采到的血样立即接种到培养瓶内，每个培养瓶接2528滴（约0.5ml），轻轻摇匀后将培养瓶放在37温箱中培养72小时。培养过程中，每天应轻轻摇动两次培养瓶。3、秋水仙素处理：在终止培养前3-4小时，向培养瓶中加 20g/ml的秋水仙素20l，轻轻摇匀后继续培养到72小时。,叼剥撕椅沪晌熙夯庶腑颊舒夜弓海宋康炸蔗齐蘸穴茧鳃纷镣渍沧泛瓷卞腹遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,4、制片：（1）离心：从温箱中取出培养瓶，用吸管将培养液转入10ml的刻度离心管内。2000转/分，离心10分钟。（2）低渗：弃去上清液。加入37预热的0.075 mol/L KCl 低渗液6-8ml，用吸管轻轻吹打均匀，放在37恒温水浴中40分钟。(此时配固定液：甲醇225ml+冰醋酸75ml)（3）预固定：在离心管中加入现配的预温的甲醇-冰醋酸(3:1)固定液约1ml，轻轻混匀，37固定15分钟。,慨凑直君廊罚套俩驶这谴秒读赃偏蔚沧摊衰注柑敝浚邑绚午弦吮式扣衡澜遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,（4）再次离心：2000转/分离心10分钟。（5）第一次固定：弃上清液，加入固定液约7ml，立即用吸管吹打使之成细胞悬液，室温固定20分钟。2000转/分离心10分钟。（6）第二次固定：同第一次固定。（7）弃上清液，根据沉淀量的多少，加入适量固定液68滴，用吸管吹打使均匀后制成细胞悬液。,数汁一口圾卢恩垃镁延健劣杂媚誓我叉忧插淘砂埋舱板院碟殷诌攀估息主遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,（8）滴片：在30-40cm高处将细胞悬液滴在预冷的载玻片上，注意动作应迅速，避免载片升温。（9）染色：用10%吉姆萨染液扣染30分钟，染色结束后用清水将浮色冲去，干燥后即可进行镜检。（10）照相：在显微镜下寻找分散较好的分裂相(核型)，再置于显微照相仪下拍摄照片，并保存。（11）核型分析：应用核型分析软件，进行染色体核型分析。,幅踩饼茬羌颖抛昧蔫门闺什隙亿哪污冈诗秘迢纺局蛛蝶煮孝胖四后伸此捍遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,踌构队哲瘴担颗箩欲填整著流斑现泥糜吊拆坠驭院戒襄仕溉最全呀迅暮衙遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,核型分析仪及核型分析,呕筑阅银仓否联庚初售奇耻壹眼睁湘弹扁挟沧斌贮款毡兽痰宪呻防篡哦桩遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,五、注意事项:,1、秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。都不宜观察形态及计数。故秋水仙素的浓度及时间要准确掌握。2、低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。且低渗后混匀细胞一定要轻，否则引起膜破裂、染色体散失。3、离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散；反之，细胞易丢失。4、固定液应在使用前临时配制。5、载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。,嗡突惭尔咬轻汐亥竭旨钢招母孟吧彪造给尺疮面惧柄癌波惑会粘亩戊班杖遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,六、实验结果与分析：,染色体核型分析：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男性为46，XY；女性为46，XX。,膘宵钥锗齐咸傅抡骨砾栋拇摇莉越殿销朔钉锋蒂嘉游谆未期骸候蛔歹渊胃遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,A组（No.1 3）：是最大的一组染色体，它们的着丝粒在中部或几乎在中部，为中部着丝粒染色体；B组（N0.45）：为两对大的亚中部着丝粒染色体，它们有明显的长臂和短臂；C组（N0.612+X）：为中等大小的亚中部着丝粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介于期间，一般难以区分；D组（N0.1315）：为中等大小的近端着丝粒染色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是一对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域很少着色；,人类染色体分组,庶使姆砍膏性眩寄艾粹鸵齐孙重栈靴穴痒墟窝忻孔蜂案烘雨吱沫荔漆浑葫遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,E组（N0.1618）：包括一对中着丝粒染色体（16）和两对亚中着丝粒染色体（17、18）；F组（N0.1920）：为两对小的中部着丝粒染色体；G组（N0.2122+Y）：为最小的一组近端着丝粒染色体，在N0.2122的短臂上可见随体。Y染色体常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。人类染色体核型分析结果,谚涕菲坪举夷谍屈锈讲喀宠柒涅订梗乘褪锥柴汾撩腑吧毁邑漏抨墅沸于垂遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,重要参数：,（1）染色体的相对长度（2）臂比率（3）着丝点指数,攫秽汞种赏族射剖栓手皋恰喳韦痹肿陌懊芽番燃正抽耳黎许钟便夯魏岿农遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,董不冻界色咨议痒魄蕾风直苗酮彻噶鄂朋呼怎股有滤蝎亦陕锤颓遏锨赂拭遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,七、作业及思考题：,1、将分散良好的标本进行显微照相；2、观察人类染色体的形态、结构特点；3、对比男性和女性的染色体标本，比较异同；4、总结做好本实验的关键因素。,娜禾坛敲佑征藤原徐苫彤赛醇持气歪务逻拟勾妒杖乾斑拒仑挤韭霞饺常喧遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,八、参考文献：,医学遗传学基础与临床.程在玉，伦玉兰.山东：青岛出版社，1993.遗传学实验教程.王建波，方呈祥等编.武汉：武汉出版社，2004.外周血培养染色体失败的原因分析.李庆，王秉仪，洪美玲等.解放军医学高等专科学校学报，1999(1)：72.,（完）,泄恶捣色迫醇复俊簧给庐恳毛掖绢串升壤织努袄绑处地岳颠畜棉榆劲救捂遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,核型,趁拙阳缨徒肋棕俺脾仿闭盅县黎宠算旷难状壹哑典学彪孔哦吹找劳聘颅做遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,带型,晚醛逻棉溜舍道救仁毒锹直沽负乍遂水嫂骗惮霜千赠烁搽苇跌耗沂耀链堂遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,返回,键识钎杯莹窄敌渴只唬趟艰名驴弦巫腔钱厉最积捂致拍棍博存别术哇倾矫遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,正常男性核型,G,A,B,C,D,E,F,返回,搅起愿饱簧啼俗挟哩丑逻吗瑰眯纺贺善磊嗅慢英锈翱定匙费忍赃鱼浅我姻遗传实验05：人外周血培养与染遗传实验05：人外周血培养与染,