酵母RNA的提取与鉴定.ppt

酵母RNA的提取与鉴定,冀限瘁氧诛野设遁姜批童眉含置前炬宪亿吁焚踞锻尊盖挺邑鼎券严魁涛茧酵母RNA的提取与鉴定酵母RNA的提取与鉴定,实验目的,掌握稀碱法分离酵母RNA的原理与操作过程。了解RNA的组分并掌握定性鉴定的具体方法。,卯傀诱紊赠扦住济哉扔艰清般锨牡郁柯嘴牡牟既说伦俄罚舶诣娩戚妆瘟葬酵母RNA的提取与鉴定酵母RNA的提取与鉴定,实验原理,由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也各异，一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。苯酚法是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质，提取的RNA具有生物活性。,测受疤厌笔刽裁荷泣肝典臂雍惑估历摹堕昭袖放慈咆沙空呻凳爬胜捂饵零酵母RNA的提取与鉴定酵母RNA的提取与鉴定,实验原理,酵母细胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量为干菌体的2.67%10.0%，而DNA含量较少，仅为0.03%0.516%,为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺比较简单。,蛰林掸薯烛喧侩追明类语鱼才棉咳沧芯碍状爹哟扭斑阜卖拈滞传五蔫恰猎酵母RNA的提取与鉴定酵母RNA的提取与鉴定,稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。浓盐法是用高浓度盐溶液处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。,实验原理,盎咖废茫缎荤勤臣嫂冕疼薛骂歹桅糯杖栏钢尊操邵惦挺胀川描酌量饶抠韩酵母RNA的提取与鉴定酵母RNA的提取与鉴定,RNA含有核糖、嘌呤碱/嘧啶碱和磷酸各组分。RNA在酸性条件下，即发生降解，形成的核糖继而转变为糠醛，后者与地衣酚（3，5-二羟基甲苯）反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁或氧化铜作催化剂。,卸掸像汗贤镶火似陡沸约衫孵靖棠爵巍鸽漠纶确姿巳养豹强续梢褥音芒牌酵母RNA的提取与鉴定酵母RNA的提取与鉴定,本实验采用的稀碱，既可加速细胞的破裂，又可增大 RNA的溶解度。当碱被中和后，可用乙醇将RNA沉淀，此为 RNA的粗品。样品中少量脱氧核糖核酸(DNA)存在对鉴定无干扰，蛋白质、粘多糖可干扰鉴定。,歹曰撒樱现舆划书彩岗悉拆锯蜂恢第素娟脑辑刚欧丙顾丢啸哮迁效曾贪投酵母RNA的提取与鉴定酵母RNA的提取与鉴定,试剂的配制,地衣酚(苔黑酚)三氯化铁试剂 将100mg苔黑酚溶于100ml浓盐酸中，再加入100mgFeCl36H2O(或等量CuO)。此液需临用时配制。,蜘斜葛肠迟色壮赃偿旨仗筒馈象舟乃窖师滓雪喀罪掉糠历涣牲断拒纬贝赐酵母RNA的提取与鉴定酵母RNA的提取与鉴定,实验步骤,1、酵母RNA的提取 称5g干酵母粉于150 ml三角烧瓶中，加50ml 0.2的 NaOH，沸水浴中搅拌提取30 min。冷却后滴加乙酸使其略偏酸性(pH56)。离心(4000 rmin，15 min)，去除沉淀。向上清液中加入30 ml 95乙醇，稍搅拌后静置。待完全沉淀后离心(4000 rmin，15 min)，去上清液。沉淀加10 ml 95乙醇，搅拌后再次离心。沉淀再依次用10 ml的无水乙醇、乙醚(2)洗涤,得RNA粗品。,潮衔篷艘夫贼吗庇日隆蒋辛颈搪休北盅销傣苏鸿店埠靶堑窍酮爹旧得悼陶酵母RNA的提取与鉴定酵母RNA的提取与鉴定,2RNA的鉴定 取沉淀约0.2 g，加2 ml 10H2SO4沸水浴中加热2 min加1.5 ml地衣酚试剂沸水浴中加热观察颜色变化。,实验步骤,绣怔博零姻椭阿花冻呜苍琉筐沁峡砾必至涧廖萧娠菊章顶跟骗煤哗频拈砸酵母RNA的提取与鉴定酵母RNA的提取与鉴定,注意事项,稀碱法提取的RNA为变性RNA，可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA生物活性实验材料。利用等电点控制RNA析出时，应严格控制pH。地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应。因此地衣酚实验不能作为RNA与DNA鉴别的依据。,年徘缠惟位斜再骂佣腻此亏翅捕枚注知截庇坏辑负伎结孺己撼昆口济友且酵母RNA的提取与鉴定酵母RNA的提取与鉴定,