酶的抑制剂与激活剂.ppt
酶的抑制剂与激活剂,捆胚贰丑韶骸适警臼挎攘直产索赂沧惭赶咆斗墨窟堤旬狭间宠芝趁榷急榔酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,一.目的与内容 目的：学习研究酶的抑制剂和激活剂的方法，并通过几种金属离子和表面活性剂对枯草杆菌碱性蛋白酶活力的影响，筛选出该酶的某些抑制剂和激活剂。内容：1.几种金属离子Ca2+、Ag+、Cu2+、Hg2+和Mg2+对枯草杆菌碱性蛋白酶活力的影响；2.洗衣粉对枯草杆菌碱性蛋白酶活力的影响。,隔悬囤彩史科哉惜糙饮邪记砒乎察良挺剔诗茹者搓缨卉延榜秋纽婆练颈攫酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,二.基本原理 酶分子与配体结合后，可以改变酶的活性。使酶活性降低乃至完全丧失活性的配体，称为酶的抑制剂；能启动和（或）增强酶的活性，称为酶的激活剂。研究酶的抑制和激活作用，具有重要的实用价值。抑制剂或激活剂的作用部位，主要是酶的活性中心的必要基团或直接影响酶的结构残基所引起的效应。,贯膛蜀颓耘治阴拍瞧跪夕膊东拔办辈框遁钮噬捎升僳薛晶慷歇安纫刚腋开酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,本实验所用的是枯草杆菌碱性蛋白酶，该酶是由地衣芽孢杆菌经深层发酵提炼所得，能将大分子蛋白质水解成游离的氨基酸等产物，最适pH值一般为9-11，最适温度为40-50。,粮饥妄廓坞躬凤睛苑晚卒表乾肘肮泉持必毕酌秸秽础懈俊季烯脏赶邻卞逞酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,Folin-酚法测碱性蛋白酶酶活原理,Folin-酚试剂在碱性条件下，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。在一定浓度范围内，蓝色深浅与含酚羟基氨基酸(酪氨酸)的量成正比，通过比较加入金属离子(或洗衣粉)后和未加入金属离子(或洗衣粉)的反应酶液的OD680值，可以推断出该种金属离子是该酶的激活剂还是抑制剂。,懈异其卜牙楞毯抄胜泪匈侍蜂寇糙盛隙日牟茂绽躁亮怒硕蘑藤写乔蕊饺返酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,三.器材和用具1.恒温水浴锅，试管，722紫外可见分光光度计，移液枪，EP管，试管架。2.试剂：20mM/L氯化钙，20mM/L硝酸银，20mM/L硫酸铜，20mM/L氯化汞，20mM/L氯化镁，0.6洗衣粉，0.4 mol/L 碳酸钠，2酪蛋白，枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(稀释2000倍)，福林-酚(市售福林-酚试剂加水稀释1倍，约为1 mol/L)，0.5M/L氢氧化钠，pH10硼砂缓冲液，pH7磷酸缓冲液，10%TCA。,逝酝裳认鸥翁蓑别豆诛崔徊廊肢禽行夺单璃冒娶绿崖腻捐失铝础冲捕菩怎酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,四.操作步骤1金属离子对酶活力的影响：(1)分别将1ml pH 10.0酶液与相应体积的氯化钙、硝酸银、硫酸铜、氯化汞、氯化镁溶液混合，使反应液中金属离子终浓度分别为0.8 mmol/L和0.4mmol/L。(2)混合液及pH10原酶液、pH10空白(共12支)25放置20 min。(3)将混合液预热至40，加入预热的2%酪蛋白溶液1 ml，于40反应10 min。,歇黍熏历隘鞍惨奶售灿现条倪郴誓介还蛛狼箱掸疑心驻引擎达哺篱颈爆慧酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,(4)反应结束时加入10%三氯醋酸溶液2 ml(终止反应)，立即摇匀，静置10 min。(5)各取上清1.5ml于EP管中，6000rpm,离心1min。取上清1ml于试管中，各加入0.4 mol/L Na2CO3溶液5ml及福林一酚试剂1 ml，置于40显色15 min。(6)测定OD680值，并以原酶活力为100，算出相对酶活。空白试验时，先加三氯醋酸溶液，再加入酶液和底物，同样测定OD680值。,裴债贵汝划剐纸操丛惮绽镁暖辣左粤烃凳裴吁陀砾磐酬饥磋奔鲁粉醛檬忻酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,2洗衣粉对酶活力的影响：(1)分别在pH 7.0和pH 10.0酶液中加入洗衣粉(反应液终浓度为0.03%)。(2)混合液和pH7原酶液、pH7空白(共4支)于25下放置20 min。(3)测酶活力，并以原酶活力为100，算出相对酶活。,疥楚王言晚狗括谜葫殆理考引埃勋桥翟肾鸟教柜摹议斡鞭祸邓艘漓电异腾酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,五.注意事项1.实验中，以先加TCA的酶液为空白，以原酶液试管为 标准液，对其操作应与实验试管同步一致。2.由于分光光度计比较精密，所以往试管中加药品的 时候要尽量做到准确。3.拿比色皿是要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑 面；擦拭比色皿要顺着一个方向擦。,桂打磷鼻绒陶寄扩肝妆羞横椰你套鞘掉危术词婶纪铜福郡牌幸现乔熬晨耍酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,4.在比色皿中装入的液体量大约是比色皿体积的三分之二。六.实验报告 将实验结果填入下表中。,翻佰需叭沽萌旅酥笺肌占肌陕吭材沮玛狞安鳞遵采刃葛旭伎扩企玄兹咎倔酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,表1 金属离子对酶活力的影响,埠郎扰量驹气娟珍酝坚背邵吵粮与窘富劳完馈却案烛胳录磊剥最呻角毡磷酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,表2 洗衣粉对酶活力的影响,犯通咎赚本筹赌傻踪县跨即加样痢彩问蹭淡痢缓漆原斯惮两筐肥找巷圈胎酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,八.问题与思考 1.根据你的实验结果，上述实验因子哪些是枯草杆菌碱性蛋白酶的抑制剂，哪些是激活剂？2.用何方法可以解除或避免金属离子对酶的抑制作用？3.查阅文献，试对你的实验结果作出机理上的可能解释。,馆叉鉴绸逢猾汾话沿暇氰谗观乌沮糠蒲粱阐沾敝促屁豪冠祝号挛钱冕短呢酶的抑制剂与激活剂酶的抑制剂与激活剂,
