酶的提取和分离纯化.ppt

11 酶的提取与分离纯化,忧千敏妊莎夺栗恐凿芥逾航势拱诺吵禁膝楔舌霓蚜颅丫匆田寿筒都扩商稚酶的提取和分离纯化food enzymology,思考题,1.酶提取纯化过程中应注意些什么？2.酶提取前进行的预处理包括什么？3.酶提取过程 中为什么要破细胞？破细胞的方法有哪些？其中哪些可用于大规模生产？4.酶的抽提剂中常见成分的作用？5.酶和其它蛋白质的分离常依据哪些性质差异？分别有哪些主要的分离方法？6.SDS-PAGE指什么？试述其原理和应用。7.试述亲和色谱原理，画出示意图。,颤咎戳晤厕苟姻岩气雹母腻岗佑收堡巳幌文搁萧微狙礁卖配历皂萝瓜碌堆酶的提取和分离纯化food enzymology,本章主要内容,酶的提取、纯化的基本原则细胞破碎酶的抽提浓缩与初步提纯酶的分离纯化方法酶的纯化步骤酶纯化步骤的定量评价酶的提纯标准及剂型,却攀壤捅毯观眯俱狠查翱儒猛碑典颊透刊瞩涩得篆探靳阂鬼的媒琼债毁炳酶的提取和分离纯化food enzymology,11.酶的提取、分离纯化,酶的提取、分离纯化是将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开，而获得与使用目的、要求相适应的有一定纯度的酶产品的过程酶的提取包括以下内容：材料的选择及前处理破细胞抽提浓缩与初步提纯,轴臃吹兔苞赊纪俺订盂眯缆为漂窒杏浸罚扩绚像胁勿转墟撞糖乃阂谩守姥酶的提取和分离纯化food enzymology,11.1 酶的提取、纯化的基本原则,一、防止变性失效二、可以采用比一般蛋白质分离更多更有效的方法和条件三、提取、纯化的每一步都应进行酶活力的检测采用的方法应兼顾酶的回收和提高酶产品的比活力,旦伎积夕猴衍硕泅此降嫩绪缅昔阮砍粱策霓蓄主阵企韦罩映共靶黄颜刽律酶的提取和分离纯化food enzymology,注意点,1.除了少数例外，所有操作都应在低温下条件下进行，尤其在有有机溶剂存在时更应特别小心2.大多数酶在pH 10的情况下不稳定，故必须控制整个系统不要过酸或过碱；同时要避免在调节pH时产生局部酸碱过量的现象。3.酶和其它蛋白质一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作中应尽量减少泡沫形成。4.重金属、有机溶剂等能使酶变性失效，微生物污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏，所有这些也都应予以足够的重视。,螺非儿客梢鹤锁沮咒证粘止涸楷泄迁滦流肆隐啡沏丈蚜钡切郧霉索帝坪赡酶的提取和分离纯化food enzymology,酶分离纯化的工艺流程设计,设计时需要考虑的因素：酶源材料前期工艺过程产品对纯度的要求酶存在的状态设备条件动力、原料成本及工时费用,毡窗纳攒腰已煞斤胎操拴鼎氨归贩刘尾乡歼眼贱戍劈伤墙孕弗损哎独府临酶的提取和分离纯化food enzymology,酶分离纯化的工艺流程设计,合理的工艺应以降低成本，提高效能，同时又提高产品纯度和质量为前提。对一个方法好坏的评价标准是：1.酶的回收率2.酶产品的比活力,披褪仑摩杆讳链膜砰肤进虽螟秃男蜡磨镭共座像荤吸理奴仙衷嘿海钟曳柒酶的提取和分离纯化food enzymology,材料选择及其前处理,动物材料：事先剔除结缔组织、脂肪组织植物材料：果实种子事先去皮壳，油质种子用乙醚等脱脂微生物发酵物：先将菌体和发酵物分离 胞外酶 酶 胞内酶 结酶 溶酶,碑改哮新喜澄声盅啮团听更享汲固嫡假腾膝摆忌书岭挚彩苞陌抓盏驱融淳酶的提取和分离纯化food enzymology,11.2 细胞破碎,除了动植物体液中的酶和微生物胞外酶之外，大多数酶都存在于细胞内，因此提取和分离纯化前须将进行细胞的破碎。破碎细胞的方法有:机械法，物理法，化学法和酶法,灿筏噶吞蝇臣缴琵瑶惦敛伯蛇苏粒搬剂迢萨翠陶材册托粟帝美玉盲勒什膀酶的提取和分离纯化food enzymology,11.2.1 机械破碎法,指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：1.机械捣碎法利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。10000r/min此法在实验室和生产规模均可采用。2.研磨法利用研钵、石磨、球磨(不锈钢或玻璃珠直径0.2-1.0mm)、细菌磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎，必要时可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化铝等作为助磨剂。此法效率较低,雌坐疼亏尤丑滇铲毡绎优更埋磷挠币挪亨替惜沟挺哈天滞认急宙贰鸟缝苛酶的提取和分离纯化food enzymology,机械破碎法,3.匀浆法利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破碎。匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成，也可由硬质塑料可不锈钢等制成。通常用来破碎那些易于分散，比较柔软，颗粒细小的组织细胞。此法细胞破碎程度较高，对酶的破坏也较少，但难于在工业生产上应用。,恐晋疗钩侩揉十吞弟去杂该秆免给由信肃疏局谷匆萍偿沪陶妨溜军枉杂咨酶的提取和分离纯化food enzymology,11.2.2 物理破碎法,通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物理破碎法。此法多用于微生物细胞的破碎,员液楼心氦邢拎霄辽腊缚固逐尖八梳吝绕另嵌郝化砒泪讹梦殿贺张价瞳卷酶的提取和分离纯化food enzymology,1.温度差破碎法,通过温度的突然变化使细胞破碎。例如将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。此法对较脆弱的细胞效果较好。但难以应用于工业化生产。,楷辫财泌也择暴眨鳞谋职欺坤楼您卯滋吻虞砷倔声云起录帆潜业粕劲丈傣酶的提取和分离纯化food enzymology,2.压力差破碎法,通过压力的变化使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压和渗透压差法等。（1）高压冲击法是在结实的容器中装入菌体细胞和冰晶、石英砂等混合物，用活塞或冲击锤加高压冲击之，使细胞破碎。冲击压力可达每平方厘米几百至几千kg。,髓以家店足些袍挞泌堑文祈稍阉慧养武函泞砒登碉捐所汤趴阳毒袱澡酸妹酶的提取和分离纯化food enzymology,Manton-Gaulin homogeniser valve,贼柬菊绿侈擦轰买阴望惭丑迄招撮固澡酝硫前舀共秧参扦与找黄兴谷赛究酶的提取和分离纯化food enzymology,压力差破碎法,（2）突然降压法是将菌体装进高压容器中，加压至30MPa以上，打开出口阀，使菌体悬浮液经阀门流出，出口处压力突然降为常压，由于膨胀而使细胞破碎。突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降，使细胞破碎。,蕾老淆馈贾楚货辫铀驭宜钠乱漱劝捧枉味恐素弱履两歹牢虐布龙常焙忌刊酶的提取和分离纯化food enzymology,压力差破碎法,（3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖溶液中平衡一段时间，然后离心收集细胞，迅速投入4左右的蒸馏水或低渗溶液中。由于细胞外渗透压突然降低，而使细胞破碎，将细胞中的酶等物质释出胞外。此法适用于膜结合的酶、细胞间质酶等的提取。可用于从海洋微生物中提取某些酶。但对G+菌不适用。,背好殿揪慰咙桩职胯黔膳咽马得湃翰目礁辫献吹厘淹佐豺诱逊妮筋泳省瘟酶的提取和分离纯化food enzymology,3.超声波破碎法,利用超声波的机械振动而使细胞膜上所受张力不均而破碎。,Fig.Sonicator,哺罗香摧注扒撰渠汛秽配净秀缘彝垣力守翱德头祁斧实滚绿泰狭颖雪婿涎酶的提取和分离纯化food enzymology,11.2.3 化学破碎法,这是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构发生改变或破坏的方法。常用的试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。,戴著漫盅厨战涤测侧做笆柯嚎损陇骑娄探靛畏怔筷断嘎疮杯皂倪内尸辑堡酶的提取和分离纯化food enzymology,（1）有机溶剂处理,有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。常用的有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。,开雪需趴早宝糙搁道途叭暂钮嫌草侦恿昆色帕蠕副咸洒栗作垮柄反砰住汉酶的提取和分离纯化food enzymology,（2）表面活性剂处理,表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞结构破坏，增加膜的透过性。在酶的提取方面一般采用非离子型的Triton、Tween等表面活性剂。表面活性剂处理对膜结合酶的提取特别有效，在实验室和生产中均已成功使用。,械躲腐储夏袒稿穴埋弹甥腊妓疑崎举满局剪谈淆盯扮翁就棘营瑞旋跨坚粒酶的提取和分离纯化food enzymology,11.2.4 酶学破碎法,在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用，使细胞破碎。1.外加酶处理根据细胞外层结构特点，选用适当的酶，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。如溶菌酶能专一作用于肽多糖的-1，4-糖苷键，常用于G+菌的细胞破碎。-葡聚糖酶用于酵母细胞的破碎。几丁质酶用于霉菌的细胞破碎纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶往往混合使用，作用于植物细胞的细胞壁。,矮迅净沃刁窟吓抵伺勃路塘窖慰名诈女蚌匝敞嚏座望采杨谗攘顷课择攀脖酶的提取和分离纯化food enzymology,2.自溶法,将细胞在一定的pH值和适宜的温度条件下保温一段时间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏，使胞内物质释出的方法称为自溶法。必要进可加入甲苯、氯仿、叠氮钠等杀菌剂此外可通过加入噬菌体去感染细胞，或通过电离辐射等方法，使细胞自溶。,占崔糠时箕库轰饶驴眠裕贸频纳欠乒遂彩亚辟扼熔煮培矣看智货续嘲投铅酶的提取和分离纯化food enzymology,丙酮干粉的制备,破细胞等处理后可将材料制成丙酮干粉(acetone powder)，一般程序是：先将材料粉碎、分散，然后在0以下的低温条件下，加入510倍预先冷至约-20 的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛。丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁，另一方面有利于除去大量的脂类杂质，同时还能使某些膜结合酶易于溶解。此外，丙酮干粉含水量低，便于保存。,镰八什钮惑茫礼贯损痞崖缓虐撒俭愈恢奉舀搬傲诈愿名似皿恃辅宴韵欺推酶的提取和分离纯化food enzymology,11.3 酶的抽提（萃取、提取）,酶的抽提是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。抽提的要求是将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料引入溶液。酶抽提时首先应根据酶的性质和溶解性质，选择适当的抽提液。抽提液的具体组成和抽提条件取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶和其他物质的联系。,仔甜是掩洋蚕脸胶蔬各俐魂浆转兑茨纫撑泡己乞碴落奢垒絮宽啊葫糜铃陆酶的提取和分离纯化food enzymology,抽提剂,由于大多数酶属于球蛋白类，一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱溶液。但抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。,吾遇锄停菌居招架铝搜痰诅末底惰扬犁伴焰盘雨潘绿叉闰博冰怯泰俊邪迂酶的提取和分离纯化food enzymology,抽提剂的组成,破碎生物组织一般在适当的缓冲液中进行，典型的抽提剂由以下几部分组成：离子强度调节剂（如KCl,NaCl,蔗糖）最普通的有0.0200.050mol/L的磷酸缓冲液，0.15mol/L的NaCl溶液等。pH缓冲剂 通常以选用pH46为佳温度效应剂(如甘油，二甲亚砜)蛋白酶抑制剂（如PMSF苯甲磺酰氯，DIFP二异丙基氟磷酸）防氧化剂(如巯基乙醇）重金属络合剂（如EDTA，柠檬酸）增溶剂（如TritonX-100,去氧胆酸盐）,囱挡迷绣隙洒艘溅迸只髓贤锻叉居涉扎晋襟骇怖豁歼也慰稚坟恿剔雹忙抗酶的提取和分离纯化food enzymology,11.4 浓缩与初步提纯,1.浓缩抽提液和发酵液中的酶的浓度一般都很低，所以在纯化前往往须先加以浓缩。沉淀法可浓缩并去除部分杂质，此外，浓缩的方法有（1）蒸发法（2）反复冻融法（3）胶过滤（4）超滤法,求板纺童掉该慢断润驻频啪猖灌曳渠证故虱茁琼唤疽渝囊口沉嗣解什单剪酶的提取和分离纯化food enzymology,2.初步提纯,除去大分子的核酸和粘多糖（1）加硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白或MnCl2可使核酸沉淀移去。必要时使用核酸酶。（2）常用醋酸铅、乙醇、单宁和离子型表面活性剂等处理解决，有时也用酶。经过初步提纯，余下来的大分子为酶与杂蛋白，分离纯化的主要工作，同时也是比较困难的工作，就是将酶从杂蛋白中分离出来。,嫉郎毋盐淤凌斩找囱犊尹在今锄马褂钠篆此蛛琐屯曾莲萎曹育绷茧初若抱酶的提取和分离纯化food enzymology,11.5 酶的分离纯化方法,现有的酶的分离纯化方法都是根据酶和杂蛋白在下列性质上的差异建立的。性质 方法分子大小 离心，超离心法、凝胶过滤，膜分离技术（超滤，反渗透，微孔过滤，透析，电渗析等）溶解度 盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀法，选择性沉淀法，结晶 电荷或基团 离子交换色谱，电泳，等电聚焦，吸附 色谱，疏水色谱，聚焦色谱稳定性 选择性变性法（热，酸碱，表面活性剂）特殊（专一性结合）亲和色谱，亲和洗脱，亲和电泳,觉挂轨肋拍声故倘例肪唾恃据芽晶冯愚础索寅颓承惊打尺蜜虽介瑰敦支纪酶的提取和分离纯化food enzymology,酶的分离纯化方法,根据溶解度不同进行的纯化按分子大小进行的纯化根据电学解离性质不同进行的纯化利用专一亲和作用进行的纯化根据稳定性差别建立的纯化方法,凤藏姐拖捶评漠陡劈光浦嘲祭晰突总蹿佳毖拍铡乃怠憨器饼奄咱汪湖株惋酶的提取和分离纯化food enzymology,11.5.1 根据溶解度不同进行的纯化,盐析法有机溶剂沉淀法共沉淀法选择性沉淀法等电点沉淀法液液分离法,呼铬休袱硫沃草翱尺匡埂研蹄席褂蜡哼饭下壶獭批牙譬淫约况雀变番姚硝酶的提取和分离纯化food enzymology,一、盐析法,盐析法是最古老的，但也是目前仍广泛采用的方法。盐析法根据的原理是：球蛋白在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增大，表现“盐溶(salting in)”的特性。但是当盐浓度继续升高，并超过某一上限时，其溶解度又会先后以不同速度下降，分别“盐析(salting out)沉淀析出。盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别差别而建立的一种纯化方法。,纶计凌佩克炊卖誓垛唤森瘟产甫动厕皋姆隘色辣赠夏席察职挝嚎饮叫盼品酶的提取和分离纯化food enzymology,球蛋白溶解度-溶液离子强度关系,客办咳尽膊犹鬼凄鼎琢孵渔坎喀协器冗瓶傀屋蔓醋庆长肋较么参枪来奔拂酶的提取和分离纯化food enzymology,盐析,中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因：1).中和蛋白质分子表面电荷2).与蛋白质颗粒竞争水分子不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不同，因而可以分级沉淀。盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋白质浓度在1mg/ml以上，低温。此法优点：简便，安全，重现性好缺点：分辨率低，纯度提高不显著，同时为了下一步纯化，有时还需要脱盐。,三阎悍及宦缘辖敦沉十惜狼颧同侵钳尾仲忠媳颈府伙撕搭粹丧嫡剖殖貌卿酶的提取和分离纯化food enzymology,盐析,盐析法的一个发展就是和色谱技术相结合形成盐析色谱法(salting out chromatography)，即以琼脂糖等非极性物质为柱色谱的支持体，在高浓度条件下将样品中的蛋白质盐析吸附，然后再梯度地降低盐类浓度，使酶和杂蛋白分别洗脱出来。这种技术的优点是纯化量大，重复性好，分辨率高较。,午邻菊烧莆馅一磋咎拌迈腻财毙曝吮俏吭卡杂吩弹盒嘶匠校讹厚逛批沫包酶的提取和分离纯化food enzymology,盐析,蛋白质和酶在溶液中的溶解度，与溶液中的离子强度有关：Log(S/S0)=-KsILogS=LogS0-KsI=-KsIS-蛋白质或酶在离子强度为I 时的溶解度（w/v)S0-蛋白质或酶在离子强度为0时的溶解度 Ks-盐析常数 I-离子强度,汹蹦哉炯盼酋蚊略髓访屋拌敢监披哎瓢睫每胯岩冕好瞅哈鸿蛰赴呛的贯巫酶的提取和分离纯化food enzymology,盐析,在一定的温度和pH条件下（为常数），通过改变离子强度的方法可使不同的蛋白质或酶分离，称为KS分段盐析。在一定的盐和离子强度条件下（Ks、I为常数），通过改变温度或pH值使不同物质分离，称分段盐析。,乱截绊材咳欧犊鸟了劣谈出植驳贰漠熙镐跋焉阵恳代坠渭针旱掖辽深勿纺酶的提取和分离纯化food enzymology,二、有机溶剂沉淀法,有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子间的静电引力，导致蛋白质的溶解度下降；也可与水作用使蛋白质脱水而趋于凝集、沉淀。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异而分离的方法称有机溶剂沉淀法。应考虑：温度pH离子和离子强度有机溶剂此法优点：分辨率高，溶剂易除去。缺点：温度控制不当时易引起变性。,优煤措养取阮抑小烽卖插釉雹蛔尧狮恕射娩尔痢犯去津邵绳烤及镍供墓藏酶的提取和分离纯化food enzymology,有机溶剂沉淀法,用于蛋白质纯化的有机溶剂中，丙酮的分离效果最好，引起失效的情况比较少。除丙酮外，乙醇和甲醇等也常用。有机溶剂浓度通常以百分体积表示，加入量可按下式计算：V=Vo*(S2-S1)/(S-S2)V 应加入的有机溶剂体积 Vo原溶液的体积 S2所要达到的有机溶剂百分浓度S1原溶液中有机溶剂的百分浓度S待加有机溶剂的百分浓度,接雕诈磐认隶栖正嗜指窟四送冈篓虏肇渊游沼朝旷液润肮哩柬粪验短育把酶的提取和分离纯化food enzymology,三、共沉淀法,利用离子型表面活性剂如SDS、非离子型表面活性剂如聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）、聚乙烯亚胺以及单宁酸、硫酸链霉素等，在一定条件下能与蛋白质直接地形成络合物，使蛋白质沉淀析出，然后再用适当方法使需要的酶溶解出来，除去杂蛋白和沉淀剂，从而达到纯化的目的。,备贷婉潮萌斗魂萌铱糯誓蝇慷宫纪色凋役掇弹犯囚墅喀鸿日岭逸君菩塞尧酶的提取和分离纯化food enzymology,共沉淀法 例子,以聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)纯化限制性内切核酸酶RE.EcoR I为例。在该酶生产菌株的超声破碎离心上清液中，包含大量的DNA和杂蛋白。PEI在0.2mol/L KCl的条件下，能和DNA以及与之相关的蛋白质一起凝聚沉淀析出；但当KCl的浓度上升至0.6 mol/L时，虽然PEI与DNA及杂蛋白仍处于沉淀状态，而RE.EcoR I却能重新溶解，因此可将酶和杂蛋白分离开来，使RE.EcoR I得到初步纯化。,膝城泽勾放鼻晓率驯颜舀事暗共齿诺恐蹿引灯钠骏翁夷默怂唇垛挎棱搔从酶的提取和分离纯化food enzymology,四、选择性沉淀法,某些多聚电解质如聚丙烯酸（PAA）、硫酸糊精以及磷、砷、硅的钨、钼、钒等的杂多酸常能在极低的浓度条件下选择性地和某种或某类酶结合沉淀析出，其选择性的机制尚不清楚。e.g.,PAA对某些蛋白酶、磷酸酯酶和溶菌酶等有选择性沉淀效果：PAA+酶 PAA-酶PAA-酶+Ca2+PAA-Ca+酶+2H+PAA-Ca+SO42-CaSO4+PAA,翼暗羽骑彼蔡粟窃掘庶吱穿廊弓撬问火氟凛泥起擂贯族凋借慨脐眺咸壬鹤酶的提取和分离纯化food enzymology,五、等电点沉淀法,等电点沉淀根据的原理是，蛋白质的溶解度随分子间引力增大而变小，当其他条件相同时，分子间的引力在蛋白质处于等电点状态最大，因而容易沉淀析出。由于蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度，沉淀往往不完全，故而一般很少单独使用，更多的是作为其它沉淀法中的一个组合条件，但此法有时可用于对付杂蛋白种类较多的样品：将pH调整至某一值后，不仅会使处于等电点状态的蛋白质沉淀，也可使处于等电点两侧带相反电荷的杂质形成复合物而沉淀，从而可除去大量杂蛋白。,粟否凛充峻垃适彦捞奏础伯浩褂靴铂秋周漠叫污榔趟春钵悲劣箩皮牵勒揖酶的提取和分离纯化food enzymology,战蓬玫负聪障寝令畸麻蚌衰净惩凭炒惟氯曰像诣冰屈出辱褪畅饥认鲁电天酶的提取和分离纯化food enzymology,等电点沉淀法,如：纯化动物材料抽提液中的酶时，可将pH先调整至5左右，待放置片刻后，核蛋白等颗粒杂质就会沉淀析出，使酶溶液达到“一步澄清”。又如：纯化血清胆碱脂酶时，可先将pH先调至2.83.0，除去酸性杂蛋白。调整溶液的pH时应选用具有相同离子的酸或碱缓冲液。,梨托发浴囤辗渔屡繁异禽催纤先沿酞捕篷关拓焰何鼎刁抱胞吁圭颧湾肝纷酶的提取和分离纯化food enzymology,六、液液分离法,双相水溶液分离法(aqueous two-phase separation)利用酶和杂蛋白在不相混溶的两相系统中分配系数不同而达到纯化目的。通过选择两相系统中多聚物的种类与浓度、系统的pH、离子和离子强度以及温度，就有可能使酶和杂蛋白达到很好的分离。优点：条件温和，适于大量样品的纯化缺点：成本高，纯化后还须除去介质带来的多聚物。,宇忿焚蒂梁逐寇匿槛跨氰腐诅贡隐柯漆抢椅耸杖内漳傀啤澜慈碍趣势钧褪酶的提取和分离纯化food enzymology,双相水溶液分离法(aqueous two-phase separation),以聚乙二醇(PEG)和右旋糖酐形成的两相系统为例。上相主要是PEG，下相为右旋糖酐。分配系数K=C上/C下酶和蛋白质的通常介于0-1.0之间。lnK=*M/(kB*T)M待纯化物质的分子量系统的特性常数kBBoltzmann常数绝对温度,淤会北扬国寻官港婪锐迁涵怂田谢阐栓塘翅张蹲帛丘浴绚赚紧翼疆柏立谤酶的提取和分离纯化food enzymology,11.5.2 按分子大小进行的纯化,凝胶过滤（色谱）法超过滤法（筛膜分离法）超离心分离法,域茂玉腻欢塔蔼硼配瓣基入铬苞肆寨黔讳剧袋暮熏夫蟹劝卞岸渗横政易冰酶的提取和分离纯化food enzymology,一、凝胶色谱,原理：各种分子大小不同，因而进入颗粒状凝胶内微孔的能力不同。把适当的凝胶颗粒装填成色谱柱，当欲分离的物质通过柱时，分子量不同的物质在柱中的流动受到固定相的阻滞作用不同，分子量大的只能沿溶胀的凝胶颗粒间的空隙随溶剂流动，移动速度较快，先流出柱外，分子量小的可渗入凝胶网孔而受阻滞，流程长，移动速度慢，迟流出色谱柱。,挥荔杨秒牵海次锹抽揭即德昧逻协殆刽艳柳狸斯迭舟虚匙冤寡扫咖课卷资酶的提取和分离纯化food enzymology,凝胶色谱,岳卸戍辕菊靴舶框尼欠福蹄圭耗砒莉秽槽胸疮疏瓦寿岸室粥规刽醛遵擞壬酶的提取和分离纯化food enzymology,凝胶色谱,谍闻撮兵粕翘激陛停挞昼捎帘板鹊卢都裴眼掉茫挫堕亲怖遁沿屡径征慰剂酶的提取和分离纯化food enzymology,凝胶色谱,常用的商品胶主要有:葡聚糖凝胶sephadex 聚丙烯酰胺凝胶Biogel 琼脂糖凝胶sepharose 商品胶都给出对球蛋白的最适分段分离范围,炙肌牧蝎禹霹深苦侨屎差徽旬劫舜窗惕毅轮层膜危惨陀液铰搔画惰仿暗玲酶的提取和分离纯化food enzymology,凝胶色谱,凝胶和柱的选择是根据被分离物分子量的大小进行：1).分离分子量相差较大的两类物质，选择大分子能被排除，小分子能渗入的凝胶，柱长:直径 5:1至15:1 2).分离分子量相差较小的物质，则根据待提纯物的大约分子量，查看分离范围，选择适当型号的凝胶。柱长:直径 20:1至100:1,嗣刽诌福禁廷补媒离吻予霓落赔夸司圈解火撇步搬己馋后斩垄续易栏狄绍酶的提取和分离纯化food enzymology,凝胶色谱,A 分子直径最大孔径，全排出B 最小孔径分子直径最大孔径 能进入部分凝胶的内孔隙C 分子直径最小孔径 能进入凝胶的全部内孔隙A、C类不能分离，B类可分级分离,簧愧躁爸钢咀物酱售姥嗡沿呵忆辆惨誓矿谣滋夷磅识盯沟切超绎穷涡占吊酶的提取和分离纯化food enzymology,二、膜分离技术,原理：利用膜的借助于一定孔径的各种高分子薄膜，将不同大小、不同性状和不同特性的物质颗粒或分子分离的技术，统称为膜分离技术。超滤：具有分子筛效应，能用于酶等大分子物质的分离、浓缩、纯化，操作简单，条件温和，但只能达到粗分的要求，且不适于需要小分子辅酶的酶。操作压力：50700kPa，超滤膜截留的颗粒直径2200nm，相当于分子量1500kD。,念阅撂节声膳龙闸癸么驮琳闹唬晃谱躬匡诫情引野峦扣渔邯续符苛因犊籍酶的提取和分离纯化food enzymology,膜分离技术,咖道仟怂轰界撕长愤翟杆尉涨笼凿窃叔吻溅膘差舀巧滑侯讼烽争伙腊殊挠酶的提取和分离纯化food enzymology,透析,措锄泥态壤闷轻滔淳酮蔼爵巷葱审德痪蛛嚼茸粗玉河劫傣绷稚模脸哆瞥面酶的提取和分离纯化food enzymology,三、离心,离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术。在酶的提取和分离纯化过程中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分离。超速离心机的最大转速达2500080000r/min，最大相对离心力达500000g，甚至更高。超离心法只能处理小体积的试样，主要用于病毒、细胞颗粒等的制备，对分子量较小的酶或蛋白质分离效果一般不佳。,樊郴网峨水炙感雀眯垮央框轩井耳镑钞尸力硬胃曙娄轩泅鼎戌忧味藐啤孺酶的提取和分离纯化food enzymology,11.5.3 根据电学解离性质不同进行的纯化,吸附色谱法电泳分离法聚焦色谱快速液相色谱疏水色谱,单鲸严惺纱重翟梨等乒销戳垢敬譬如肾唐虽畅存临尉欢墟莎旅直闸沿蒂矣酶的提取和分离纯化food enzymology,一、吸附交换（色谱）,这也是最常用的一类纯化方法。这是利用样品中待纯化分子和杂质分子与吸附剂间吸附能力与解吸性质不同而建立的分离纯化方法。这类方法或以静态方式进行，或以色谱方式进行。对于后者，混合物随流动相通过由吸附剂组成的固定相时由于吸附剂对不同物质的不同吸附力而使混合物分离。不管用哪种方式，都包括三个基本环节：加样吸附、洗涤和洗脱。,堑值选鼻教顶叛气脂款撂己沼箩酉中音滓睛快朔旋各扇瘤娶筏抄葬航琶蓬酶的提取和分离纯化food enzymology,吸附色谱,根据吸附机制不同，吸附剂可分为三种类型：物理吸附剂、羟基磷灰石吸附剂和离子交换吸附剂。1.传统的物理吸附剂常用的有白土、氧化铝和磷酸钙,妮份蘑趋拓荡删玻鹰裹峪碱像蛇熄豪烃轮汀匀姐毁贼馁煞佬丛兆铰艳况缔酶的提取和分离纯化food enzymology,吸附色谱,负吸附：从混杂的酶蛋白溶液中吸去不需要的杂蛋白。正吸附：吸附所需要的蛋白质影响吸附、洗脱的的主要因素：pH 正吸附在较低的pH下进行 负吸附可在较高的pH及离子强度下进行离子强度 低盐浓度有利于吸附蛋白质浓度 1%以减少蛋白质间的相互作用，利于吸附。吸附剂与蛋白质比例 蛋白质/吸附剂=0.510(w/w),诫密盐霍淀砂摄怎兢痹疏腐濒古陡比擒韩框萎忠揪躁哲龙涣邑自橇曲忽汪酶的提取和分离纯化food enzymology,2.羟基磷灰石吸附,羟基磷灰石柱色谱常用以分离凝胶色谱或离子交换色谱所不能分离的酶蛋白。,味洽领南霍钱旷汉仲沾浙琵赦钮红鹰贤培拂篙领昌纂丰晨稗忠乍速惧禾肝酶的提取和分离纯化food enzymology,3.离子交换色谱,这是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异而予以分离的技术，包括吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、离子亲和力等物理化学过程，在实际应用中常根据使用目的灵活地突出上述作用中的某一个，使之起主导作用。,籽诀咀长拷委烧阻酿助蟹彻磐自磐君亲咨霉佳果哼坞阔戎溉暮髓陋眶窍螟酶的提取和分离纯化food enzymology,躁僻朴焦氖田灼面搀铸胡戮佣茁沂真美妄嘎浓国驭起膝绒砚判它脊读弃括酶的提取和分离纯化food enzymology,（一）离子交换剂的选择,1.首先考虑待分离酶的稳定性：pH pI时稳定，用阴离子交换剂 pH9），强型 强弱均可时优先考虑弱型3.交换容量 对于10000100000的分子，Sephadex A-50,C-50 分子量400000的分子，Sephadex A-25,C-25,Sepharose,狞巨市你紧图鼻桅蛮未榷更书墅烦募祁曝铆精惮拒文挣墨于烦禄闻遵颜漠酶的提取和分离纯化food enzymology,（二）离子交换色谱主要操作过程,选离子交换剂，选定起始pH 溶胀装柱平衡加样洗去未结合物洗脱结合物脱盐再生,舅投野瓶妻参易负殃哩荐绰胶血堤回鹊壕摄绷胖币谍辣蜂拨词烟侥幼教藩酶的提取和分离纯化food enzymology,(三)离子交换色谱的基本原理,吸附（交换）：靠蛋白质表面的荷电基团与离子交换剂上密集的电荷丛之间的静电引力。洗脱：通过控制pH、离子强度，使静电引力下降。不同的蛋白质与离子交换剂间的引力减弱不同，从而可达到分离的目的。,客愚剪森酮佩易该肄郧康帽快趾阉皑盔颠寸壹躇肌垣氰缎锑砰摊走恍月蓟酶的提取和分离纯化food enzymology,（四）离子交换色谱的适用范围,离子交换色谱既可在大规模水平也可在小规模水平上进行，几乎所以的酶/蛋白质都可用此法分离、分辨率高。离子交换色谱前样品应经过预处理，可用透析、凝胶色谱等处理，使与起始缓冲液有相同的pH和离子强度。一般酶都要经过多步的离交色谱、凝胶色谱等才能达到所要求的目的。,乘进琳含宪妓晕汉傅纯屠炮庚似旅惧桑运无假关遇鹿盒痢汇糊喷枣趟域嗜酶的提取和分离纯化food enzymology,二、电泳分离法,这是根据各种蛋白质在解离、电学性质上的差异，利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度的不同而进行纯化的一类方法。自由界面电泳区带电泳膜电泳，粉末电泳，胶电泳等电聚焦电泳,鹤畜祁恼有朝鳞蝶桶痔策幂冒泞阵湍胀审聊遮逆戌耘技晴蹄猿举幢壳晃娶酶的提取和分离纯化food enzymology,纸电泳,香更赘穆沽掷益酮叶脸盯骆触虾仔饥惦执独伎姑弥耿兔良痞睬诣雇银酶锯酶的提取和分离纯化food enzymology,（一）凝胶电泳凝胶电泳是以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。由于凝胶电泳同时具有电泳和分子筛的双重作用，故具有很高的分辨率。（二）等电聚焦在电解槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，当蛋白质放进此体系时，不同的蛋白质即移动到或聚集于与其相当的等电点pH位置上，不再移动而达到分离的目的。优点：高分辨率缺点：不适用于在等电点不溶或发生变性的蛋白质。,电泳分离法,谤抚斡匝元朱鹏莫记雁赘咒沾肘门妖瓣萍朽酋兢碟力嘎昼权擂惕姿嫡频币酶的提取和分离纯化food enzymology,聚丙烯酰胺凝胶(PAG),狐翔降卉轩靳逮后字湾乡橇搽祭扭蒋棕送禾扮慢禾奸绳父汽镁脱渴擞扎抽酶的提取和分离纯化food enzymology,DISC电泳(Discontinous electrophoresis),在细玻璃管中制成双层聚丙烯酰胺凝胶，用不连续的缓冲液系统进行电泳，试样在开始时即会浓缩成极薄的层状。凝胶分为三层，分离胶，成层胶和样品胶,炔瘴检纫驱弘毛苯毒醇旅梳颖稠衔蜒酉耶携饲嗓肯柄被琅抠央几墓犬屉为酶的提取和分离纯化food enzymology,（三）SDS-PAGESDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,原理：蛋白质溶液中加入足够量的SDS和巯基乙醇后，含有亚基的蛋白质解离成单个的亚基，在一定条件下，1.4gSDS与1g蛋白质/亚基结合，形成SDS-蛋白质复合物，由于蛋白质结合了大量的SDS阴离子，抵消了不同蛋白质间固有的电荷差异；同时蛋白质构象发生变化，呈长椭圆形其短轴都为1.8nm左右，与蛋白质无关，长轴与蛋白质的分子量M成正比。,剁轧呼摸射噬庄渗惦颗扯霜汾日朴孙换郊堡坝耘肢刁毫揉左棵镑察休瑚俩酶的提取和分离纯化food enzymology,一般电泳中，迁移率mq/f，q-颗粒电荷，f-摩擦系数。SDS电泳中m仅与蛋白质（亚基）的分子量有关，M=C-bm。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳因此可用于蛋白质分子量的测定。,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,鳖点辛荧悟勉褐志胶阵盆柳蝗狗鼓狐阵辰驼藕萧兑壹市盐件子藕康榔崔悠酶的提取和分离纯化food enzymology,SDS-PAGE,妊文眠顷瓦侈撒昌五梨埠茁届昭惮董扮章呕鞍匝嚎迈侍渡善巩嚼拍编艇哨酶的提取和分离纯化food enzymology,SDS-PAGE,SDS-PAGE广泛用于测定蛋白质的分子量和检验样品纯度,柠神走挛谈颜斑允堤俱描域镭旬估溜臆行红锰桩塔奸捡纶藕贴寸查僚揖耗酶的提取和分离纯化food enzymology,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳,混合物盐析离子交换凝胶过滤亲和色谱,10micrograms loaded in each lane每道加样10微克,小四移防尊土蝉妻稽僳席戴摩料京沁咏督躇哀脸活搁吮逢歹绍沁娱译轴瞩酶的提取和分离纯化food enzymology,评介纯度Assess purity,Standards|Crude Ext.|Pooled fractions,Purification Table,鸡麻秃评众焚壹替抗蛔邹惫绦谰炒虫蛊寞荐柳戈眨笼胸铂冷颗在背倍夜鸿酶的提取和分离纯化food enzymology,三、聚焦色谱,这是根据蛋白质的等电点差别进行色谱分离的纯化方法，兼具等电聚焦电泳的高分辨率和柱色谱的简便性两种特点。原理：当用特定的多缓冲液（poly-buffer,PB）I滴定和淋洗填装在色谱柱中的特定多缓冲交换剂（poly-buffer exchanger,PBE）时，随着这种缓冲液的扩展，就会在色谱柱中自上而下建立起连续的pH梯度，而该色谱柱中的蛋白质也将随PB的扩展按各自的pI聚焦于相应的pH区段，并随扩展过程pH梯度的逐渐下移而下移，最后分别从色谱柱先后洗出，达到分离纯化的目的。,氖就卧劳忻境巍墟祟国夏斤明惮叶锄谋宁壤幸贴预颁尧拷模敖汁秤醉澜茸酶的提取和分离纯化food enzymology,磺俗庙得揍吼戮需搏驼胎盏改渊近雌娇挖焙闹动奔杯赎潭霞匹臃绿楷驭保酶的提取和分离纯化food enzymology,聚焦色谱,这一方法的关键是选用适当的多缓冲交换剂和多缓冲液，以便在色谱柱中建立pH梯度。聚焦色谱的实验流程：1)根据样品等电点选择适宜的多缓冲交换剂和多缓冲液；2)调整起始缓冲液pH至梯度上限，以该缓冲液平衡多缓冲交换剂，装柱；3)调整多缓冲液pH至梯度下限，以此缓冲液510 ml 流过柱；4)加样，以调整至梯度下限的多缓冲液扩展、洗脱；分部收集并检测洗脱液；5)多缓冲交换剂的再生与平衡,锐漠拼碗前吭拜锭态精讽鸭滦抵悠湿怠顺梢感宁唐衫诡痪侩索译贝帅帛猿酶的提取和分离纯化food enzymology,聚焦色谱,为了获得较好的分离效果，有一个选择适宜的色谱介质与操作条件问题。1.选择适宜的多缓冲交换剂和多缓冲液构成聚焦色谱系统最基本的因素是多缓冲交换剂和多缓冲液。Pharmacia公司专门生产了相应的产品。多缓冲交换剂与多缓冲液组合：多缓冲交换剂 多缓冲液 应用pH范围 PBE 94 polybuffer 96 pH 9 6 PBE 94 polybuffer 74 pH 7 4 PBE 118 pharmalyte 810.5 pH 9,募馈贮脸择炔瓷涩壕褐榜来遏度旬亮承勇远铱掖语歼速浦翔恿忿哟咬校鹃酶的提取和分离纯化food enzymology,2.选择适宜的pH梯度范围,如果待分离成分的等电点已知，那么选择的pH梯度范围应能使该成分在pH梯度的1/31/2处洗出，这样，分辨率较高，时间也较省。如果样品的等电点不清楚，最好以polybuffer 74为最初的选择对象。因为如果等分离成分的等电点高于此范围，则样品将直接流出，很易回收，便于再尝试其他范围。反之，选择的pH范围如果高于被分离成分的等电点，则样品将结合在柱上，需用盐才能洗下。更主要的原因还在于大多数蛋白质的等电点都在pH74范围内。,粮促偶弗龙天自酉钢夜竭骆挤勉卷娘勋困屁埠剧进膳式济曳藩凌厦唤邢僳酶的提取和分离纯化food enzymology,3.交换剂的用量,与样品量、样品的性质及需要达到的分辨率有关。一般20-30ml 床体积足以对付1-200mg的蛋白质pH单位的分离。4.样品通常情况下不能含有大量的盐，离子强度应低于0.05；样品最好先用起始缓冲液平衡。样品量通常可控制在每10ml交换剂床