DNARNA蛋白质等各种生物物质地保存.doc

word各种生物活性物质的保存Experience 2009-08-16 16:34:36 阅读336 评论0  字号：大中小 订阅DNA、RNA、蛋白质、抗体和探针的保存方法：网上搜索，仅供参考_      短期保存，两年之内吧，无菌水和TE缓冲液是ok的。如果是长期保存，比如10年20年的话，我推荐你刚提取好的DNA直接保存到乙醇里，放20°，放10年没问题。需要用的时候，再离心后，弃去乙醇，加水或TE溶解即可。      长期保存用TE，DNA本来就是酸性，所以需要弱碱性环境保存，如果用中性或者酸性环境保存容易降解。保存两年应该会降解的！还是不要超过两年，再一年内都有降解的可能，所以还是要尽快的利用了。做成干粉不太可能，哪里有那么多的量！还是在80度以下保存吧，也要防止反复冻融。       如果DNA很纯的话，应该影响不是很大啊，有文献报道高纯DNA的最优保存条件是4度，你也可以应证一下你的DNA有没有降解啊，跑个电泳看看啊，如果出现smear，就不要用了啊！         提纯的DNA放在4度一段时间数周-数月都没问题。但是长期保存建议-20度，并且浓度不要稀释的太低，否如此容易降解。         RNA假如要长期保存,需沉淀下来后置于无水乙醇冻在-70度,用的时候再离心下来除去无水乙醇,用DEPC水溶解。      保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品如胰脏、肝脏中别离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就根本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用如下方法沉淀RNA：参加NaAc至0.3M，12,000×g离心5分钟。      RNA即使是放在-80度下也会降解，所以最好的保存方法是将RNA逆转成cDNA后保存。      提取的RNA保存在DEPC处理的水中，参加RNAse抑止剂，在-80度保存2个月，应该是可以保证不降解的。最好是反转录后保存。      一旦生物样品被收集采摘，离体组织的RNA会立刻变得非常不稳定，极易被降解。由于特异与非特异的RNA降解，或者由于样品采集过程中的应激反响产生新的RNA都会引起RNA状态的改变。对于生物芯片、基因表达矩阵分析Array Analysis、定量RT-PCR等实验来说，采样后立即稳定样品里的RNA以保存当时RNA的表达状态，是准确/定量研究基因表达分析的重要前提。记得以前学植物遗传的同学常常要带着液氮罐，骑着单车到田里采样那个液氮罐的盖子有点问题，一颠就冒白烟，吓得一路上行人、车辆纷纷躲避，很是招摇，据说有一次觉得液氮不够了，赶着坐出租回来，那可是连哄带骗才上了的士，到学校时司机已经紧X得面无人色了这真令贪玩的我们非常羡慕，只恨这等趣事怎么就落不到我们头上。对当事人来说，每周一次带着液氮罐到处跑实在不算一种有趣的经历。没有方法，为了保持样品的RNA完整真实，要么当场提RNA，要么液氮保存，一直如此。不过自从有了RNAlater，这种有趣的场面就会越来越少了。      RNAlater是特殊的样品储存液，只要在采样后立即将新鲜样品浸入这种液体试剂，RNlater可以迅速渗透到组织或其他生物样本中，稳定并保护RNA完整而不被降解，确保下游分析得到的数据真实反响样品的表达信息。样品储存液中保存的新鲜样品可以在不超过37度的高温天气下保存一天，或者在25度室温下保存一周；或者4度冰箱存放一个月；或者负20度长期保存而使RNA保持完整免受降解。这种技术为在不同温度和不同地点下的采样、运输和保存样品提供了极大的方便，同样适合手术/解剖过程中局部样品的保存。    RNAlater的用法非常简单，只要在采样后立即将样品完全浸入适量10ul/1mg组织或者5倍体积的RNAlater中即可。取样的动作要尽量快速利索，组织样品的大小以厚度不超过0.5公分为宜。对于一些小的组织如小鼠的脾、肾等器官如此可以整个取出浸入溶液中，较大的如此应切开为厚度小于0.5公分的小块，以确保RNAlater 能迅速扩散渗透入组织块中的所有细胞中。采样的容器应该足够大以容纳10倍于组织重量的溶液，防止组织块挤在一起，同时建议将溶液加满容器以防止在运输过程中组织块露出液面。    保存在RNAlater中的样品RNA可以:· 37下稳定保存1天· 18-25保存7天· 2-8稳定4周· -20永久保存      辛辛苦苦纯化得到的那么一点蛋白，可千万不能因为不懂得怎么保存而白白浪费了！选择什么样的贮存方法取决于该蛋白的稳定性和你打算保存多长时间以与下一步你打算如何利用。一般来说，蛋白溶液应防止极端的pH强酸or强碱，同时也不能接近其等电点的pH。另外，还应该防止其他物质的掺入。      如果保存时间在24h以内，大多数蛋白可以放置到4。如果保存时间在24h以上，应该考虑防止蛋白溶液长菌，可以事先过滤一下through a 0.22 m filter或者参加抑菌的物质如叠氮化钠。       如果保存时间超过一周，如此应该将蛋白溶液冷冻起来。通过液氮或干冰冷冻的方法使蛋白溶液迅速冷冻，可以有效防止蛋白的变性。为防止屡次冻溶致使蛋白活性降低或变性，应该将蛋白溶液分装保存，一次用多少就取多少。除此之外，还可以参加一些甘油(5-50% (w/v)或者血清(10 mg/ml)帮助目的蛋白保持稳定。      如果打算保存数月之久，如此需要将其放置于20，此时要参加一定量甘油，防止“冻伤。       另外，还可以用硫酸铵将蛋白沉淀置于4保存损失较多，不建议采用；也可以将蛋白以干粉状态保存保存时间最久。-      新提取的蛋白可以分装存在-80度冰箱 ，保存保险系数1年，如果参加buffer煮过的蛋白在-20保存。最好提取的蛋白，一局部保存，一局部立刻加Buffer煮，做实验。-蛋白的稳定性与保存方法PIERCE公司技术资料Proteins prise an extremely heterogeneous class of biological macromolecules. They are often unstable when not in their native environments, which can vary considerably among cell partments and extracellular fluids. If certain buffer conditions are not maintained, extracted proteins may not function properly or remain soluble.Proteins can lose activity as a result of proteolysis, aggregation and suboptimal buffer conditions. Purified proteins often need to be stored for an extended period of time while retaining their original structural integrity and/or activity. The extent of storage shelf life can vary from a few days to more than a year and is dependent on the natu of the protein and the storage conditions used. Optimal conditions for storage are distinctive to each protein; nevertheless, it is possible to suggest some general guidelines for protein storage and stability. mon conditions for protein storage are summarized and pared below.Generally, there are tradeoffs associated with each method. For example, proteins stored in solution at 4 can be dispensed conveniently as needed but require morediligence to prevent microbial or proteolytic degradation; such proteins may not be stable for more than a few days or weeks. By contrast, lyophilization allows for long-term storage of protein with very little threat of degradation, but the protein must be reconstituted before use and may be damaged by the lyophilization process.       -问：纯化后的蛋白质4度保存约15天，怎么分子量发生了变化？答：蛋白质样品如果是溶液状态的，在4度下顶多保存一个礼拜。15天太长了。估计分降解成很多小蛋白。电泳时出现很多条带。在-20度也就是保存一个月。最好的保存方法还是将蛋白样品冻干成粉末。保存，这样保存的时间会很长。如果条件不具备，-70度也可以。蛋白样品最忌讳反复冻融。答：蛋白保存应根据对活性的要求与蛋白的种类而定：抗体:除非一些公司特别要求-20冻存，一般4可稳定一年无菌，如加叠氮钠，因为抗体是一种具有非常稳定结构的蛋白；要求具有活性的蛋白,最好根据需要小量保存4(一周、-20(一个月)、-80(六个月)、液氮根本无限期，反复冻融会导致诸多不良后果，如聚集、修饰、降解、污染等取决于蛋白浓度、缓冲液成分与蛋白本身的特点；冻干是一种很好的长期保存法如条件具备，在大多数情况下可以很好地保存蛋白的活性，但不适于某些蛋白因有些蛋白对冻干重溶时必然产生的盐离子浓度的急剧变化反响不佳，其活性会永久丧失应具体对待，尚无规律可循。另：蛋白聚集与二硫键形成是两个概念，巯基乙醇只负责维持-SH的游离状态，形成二硫键是一化学反响，产生纯净物，聚集一般只通过一些离子键、X德华力、疏水力形成，可以用物理方法分开。答：较长时间的保存最好用DTT。在参加缓冲液中24小时内，巯基乙醇被氧化，其后可加速蛋白的失活，而DTT不危与蛋白质的巯基。因此，最好是在制备蛋白质样品的时候用大约12mmol/L巯基乙醇，而长期储存如此使用1-5mmol/L的DTT。见蛋白质技术手册另外，我有印象看产品目录的时候，看到有一种用于western的试剂盒，提供的试剂可以在复原二硫键之后在巯基上烷基化，这样就防止了二硫键的再次生成。     抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低10-100Mg/L，就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。       绝大多数已稀释的抗体应存在4-8条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已别离的免疫球蛋白组分应保存于-20条件下，并防止反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对防止用高温快速解冻。       被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液与其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中参加0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻枯燥后置-20以下可保存3-5年。       保存稀释后的单抗应参加0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进展冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4下保存数月。 -      其他须知事项：      分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于屡次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以与管壁吸附的影响。       复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4oC，防止再冻起来！ 抗体工作液应该当天配制当天用完，在4oC 尽量不要超过1天。绝对防止将抗体保存在自动除霜冰箱中。尽量将抗体保存在冰箱里层，而不是门上。     无论是保存还是运输，绝对防止反复冻融！反复冻融会导致抗体变性，导致多聚体形成，从而降低抗体的结合能力！-      蛋白在高浓度时更不容易降解1 mg/ml 或者更高，这就是为什么在抗体中参加BSA之类作为稳定剂的原因了；另一方面，参加的蛋白也可以减少抗体由于管壁吸附所造成的损失。但是如果抗体要用来标记的话，如此不能参加蛋白稳定剂，因为这些稳定剂会和抗体一起竞争结合标记物。-      为了防止微生物污染，叠氮化钠经常被参加到抗体中终浓度0.02% (w/v)。 叠氮化钠会干扰任何含有氨基基团的偶联，因此在进展偶联之前，应将叠氮化钠去除。偶联后的抗体可以参加叠氮化钠保存，但是浓度只能是0.01。对于需要偶联的抗体，thimerosal (merthiolate)可以替代叠氮化钠作为保护剂！注：叠氮化钠的去除方式：       可以通过凝胶电泳或过滤的方式去除！IgG的分子量是150kDa (IgM 是 600kDa); 叠氮化钠的分子量只有65Da。使用cut off 14kDa的滤膜即可将叠氮化钠从抗体中去除。      纯化IgG: 不要保存稀释的抗体,高浓度有利于保存。IgG会粘附于玻璃或塑料，低于0.1mg/ml的蛋白会很快被吸收并变性失去活性。-      下面是我的读书笔记，内容全部摘录自Using Antibodies这本书。该书中专门有Handling Antibodies这样一个章节，对于像我这样的入门级还是很有启发的。      首先要树立的一个观念是“抗体可一点儿都不脆弱，很强悍的。 “Antibodies have a pact three-domain structure that has evolved to retain activity in most biological settings. One practical advantage of such pact and stable protein domain is that they are resistant to a broad range of mildly denaturing conditions, making long-term storage of antibodies relatively easy. Storage buffers seldom need to be supplemented with glycerol or other stabilizing pounds that are monly added to help maintain the activity of proteins purified in the lab.经常使用的抗体可以4保存；长期保存可以置于-20。“Working solutions of antibodies are conveniently stored at 4. At this temperature they are stable for months to years without loss of activity. For long-term storage, antibodies can be kept conveniently at -20 in the serum, tissue culture supernatant, or ascitic fluid in which they are collected. Lower temperatures will not hurt the antibody activities, but there is no significant advantage in lower-temperature storage.也有例外，不是所有抗体在4都稳定，有些得在常温保存。“The only group of antibodies that should not be stored at 4 are the so-called cryoproteins, which are sensitive to low-temperature storage, where they precipitate. Some mouse antibodies of the IgG3 subclass may fit these characteristics. If antibodies precipitate at 4 over time, they should be kept at room temperature with addition of sodium azide.尽管抗体很稳定，还是要防止反复冻融，因为它可能造成抗体活力的丧失。原因是.“Antibody solutions should not be frozen and thawed repeatedly, because this can lead to denaturation of antibodies that may lead to unwanted protein-protein aggregation. Aggregation of antibodies can cause the loss of activity due to steric interference of the antigen bining site or by generating insoluble material that is lost during centrifugation or filtration.抗体到底可以保存多长时间？什么？十年？“Antibodies are remarkably stable. If tightly sealed to avoid evaporation, they can be stored at 4 for months with no loss of activity. Antibodies stored at -20 have been shown to keep their activity for decades.这么强悍！那，抗体到底怕什么？“The only problem monly encountered in storing antibodies is contamination of these solutions with bacteria or fungi. This can be prevented by addition of antimicrobial agents; for example, by adding sodium azide to 0.02% or, as an alternative, Merthiolate to 0.01%.何时需要添加叠氮化纳？什么时候又不能添加？“Although useful and effective for most settings, sodium azide is not appropriate in some assays, because it blocks the cytochrome electron transport system and therefore is toxic to most organisms. In addition, the primary amine on the azide would attack the stability of the antibody's interaction with conjugate or matrix in coupling methods. If sodium azide is already present in a solution, it can be removed by dialysis or gel filtration.自己纯化的抗体，保存的时候要注意什么？Purified preparations of antibodies are stable in most monly used buffers. The pH should be kept near neutral; pHs between 7 and 8 show no deleterious effects, even over many years of storage. Salt concentrations between 0 and 150 mM are suitable for most applications, but little harm is caused with long-term storage in salt concentrations up to 500 mM. If no other indications are known, we remend long-term storage in PBS or 50 mM Tris, pH8.0. If there is no reason to avoid the use of sodium azide, add it to 0.02%. Aliquot samples of the purified antibodies into convenient volumes and store frozen at -20. Solutions of purified antibodies should be stored relatively high concentrations(i.e., 1 mg/ml) at neutral pH. Concetrations up to 10 mg/ml are monly used. Antibodies at lower concentrations should be concentrated prior to freezing.     荧光探针的保存方法：1. 荧光探针必须避光保存。 2. 干品可于-80保存一年以上,如无条件，请于-20保存。 3. 强烈建议用RNase-free的TE (pH8.0) buffer溶解探针，这样得到的探针溶液更稳定， 保存时间更长。通常，将探针配制成100 pmol/l的储藏液，分装成几份(每份最多反复冻融5次)，于-20保存。使用前，将配制好的储藏液稀释成工作液(10 pmol/l或20 pmol/l)，剩余局部于-20保存。     保存的时间与保存条件和探针的种类有关，不能一概而论。15 / 15