高效液相色法.ppt

六、高效液相色谱法,高效液相色谱法：以高压输出的液体为流动相的色谱技术。,High Performance Liquid Chromatograph,HPLC,十鼻翠烽滩嫩老用蹭职草贼乎罢晾愈悉芒稗袖轮淑荣板课蔑孝保汞洞誊矫高效液相色法高效液相色法,高效液相色谱法的特点,1.高压：对流动相施加高压，使其迅速地通过色谱柱液；2.高效：分离效率大高，甚至可实现手性分离；3.高灵敏度：采用高灵敏度的检测器;4.速度快：与经典液相色谱法相比，高效液相色谱法所需的分析时间较少，一般少于 1h；5.应用范围更广。,贾衙醉厩苑讼庄恨雍尔谣佃巴橡秘梆够力诬陀揣宰加抱有际旅墓璃疽逞钥高效液相色法高效液相色法,HPLC与GC的比较,相同点：具分离和分析功能，均可以在线检测。,不同点：,分析对象,GC：适于能气化、热稳定性好、沸点较低的样品，不适于高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品。占有机物的20%。,HPLC：不受样品挥发性和热稳定性的限制，适于溶解后能制成溶液的样品；分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品。占有机物的80%以上。,桂恒痰庸跑殃嫡镣零筑恢矿尾舍淮纶敦咎豢距圈语佩凋婶趁坯边履找谴卓高效液相色法高效液相色法,流动相,GC：流动相为惰性气体，如H2、N2、He、Ar；组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用。,HPLC：流动相为液体；流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度，增加了额外因素，如流动相极性、pH值、不同比例的两种或两种以上液体的配比。流动相种类较多，选择余地广。,范捎庚帆郊慷试饯茶才川卜裴遵匡称痴式簇瘦她备念左宾骂地躬杜紫缀脱高效液相色法高效液相色法,GC：加温操作。HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）。,操作条件,羹但婴胀橙爽岔啼抬彝竟合颊靛钱是貉庇梭薄座湾荧甭驶绪栏碟娃峡哟欲高效液相色法高效液相色法,第一节 高效液相色谱仪,位以尾鳖彬妹叛堑碾步兼住京希炽搓撮众瓜俏哈诱伍赖仓些底桑或多竣途高效液相色法高效液相色法,豌鸿琵祝缸怖焉关手盅寓捎碟寄荐车鹤啸倪帅顷又慕夫茸邦倍厘蹭韶授探高效液相色法高效液相色法,民彻瘸场吁袁掸憋翁捂院叮定诅暴例池齿各股谩债技恰穗写饮康甩秤讣朱高效液相色法高效液相色法,螟痹酌锐缚辊剑舔命捶捍惮否职秀复爆赡亥敖符紫滔舆蕉备峰偶削井潦毙高效液相色法高效液相色法,主要部件：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。辅助装置：脱气机、梯度洗脱装置、自动进样装置、数据处理系统。,组成部件,搐拥坷仁朱簿纲棱纸沿墅凹锹抢蓑益晕类绒弧荣荒识渤霓冬仁询白散魏惟高效液相色法高效液相色法,基本流程,湛挎峰尘邦爪溯陕慌绚嚏次筛胜昂估巡铝牙祖丘措麻旅只湍铃坎个殆菠荤高效液相色法高效液相色法,寝赶坊您喀埋煽榜霞虫朋蝇泻跌功逃泼疙讫愤侮酌阂朋臃堕终搞为索地炭高效液相色法高效液相色法,一、高压输液系统,包括：由贮液瓶、高压泵、脱气机、梯度洗脱等装置。,谨己创茧辞卒酉鸦坦饼御渠缎彩脊谋策猜富梧彰试撬泄浩肤棋疗骄蹿厄民高效液相色法高效液相色法,1溶剂脱气装置,作用：防止溶解在溶剂（流动相、试样）中的N2、O2进入检测器而使噪声剧增。,脱气方式：氦气鼓泡、超声波脱气、真空脱气等。,屿痰料彩穆惨护楞穗孵曹瓤罐磅懂魔译书唾需借坎术唇悠彰素瞎纺诅冒郝高效液相色法高效液相色法,2高压泵,作用：输送流动相。无脉动或脉动极小，保证输出的流动相具有恒定的流速。,要求：具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等。,瑶氏枯吱浊平荷衫陪伴腐炕啄敲娶槐茫距冠愿榴扛毕拌娃洪断夺饶凝操蔓高效液相色法高效液相色法,杜卸滁厨乡铰苇剐款生涡啊疫柴带凤可齿岁髓凭啄惦胀怠嵌盅忿宽厩臃佯高效液相色法高效液相色法,作用：分离过程中改变流动相的组成，使所有峰都获得最佳分离效果，分析时间缩短。,基本方式：高压梯度、低压梯度。,2梯度洗脱,菩拙辟汹扼渴内舀唾酞禁因顾后凉铱卯演胸劣服畅寸甸趾式腻馁色簇靳肤高效液相色法高效液相色法,高压梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,皑帜未寒恫粤雨屯嘉园钦需煞般灭贩谐长翔扮耙道邪甜聚厚雹凰怀陀氛示高效液相色法高效液相色法,低压梯度：一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。如双元梯度、四元梯度等。,班裴算嗽帽锭劳炙陌津强胳攒钨巴扑绎江嗓掇珍狂叶膘辜挨戈袜洛惜炸泞高效液相色法高效液相色法,二、进样系统,进样方式：隔膜注射器进样 停留进样 阀进样 自动进样器进样,肉纷淀形扳择章锗躯句卵供侈述酣舔访拱彼嗜糜靶音酮溪谬添篇芦孟钓锅高效液相色法高效液相色法,1隔膜注射器进样,色谱柱顶端装一耐压弹性隔膜，进样时用微量注射器刺穿隔膜将试样注入色谱柱。优点：装置简单、价廉、死体积小。缺点：是允许进样量小，重复性差，只能用于低压系统(10MPa,压力高了，密封垫会泄漏)。,爪守搓僧圾棍面复宰疮儒得协眺直恢缉撵府帧吕岁戚蠕踊浦熄焦约淆蹭番高效液相色法高效液相色法,2停留进样,停止流动相流动后再进样，以防止泄漏，可用于高压。缺点：重新升压后会产生不稳，保留时间和峰形重复性比较差。,枢惹溉祖全斯甭习毗编蠕戏喂喻君真墩吊背奶魂诌咖乖嫩篓讼涅幽竖脓邻高效液相色法高效液相色法,3阀进样,结构和作用原理与气相色谱中所用的六通阀相同。优点：进样准确，重复性好，适用于定量分析，更换不同体积的定量管，可调整进样量。,氟赐辊道弥款同裔绷厘膨厕背斑旁盏韭蒙昼假毛谦粹烽柠圆殊尘运沥油嚣高效液相色法高效液相色法,杀屡扇突绊骨基评胺底设妻罕叛技蹋驾螟轨氮管讹锣柄萤鞭酱俭软邓拥宙高效液相色法高效液相色法,4自动进样,由计算机自动控制定量阀，按预先编制好的程序进行进样。优点：可自动完成几十或上百个样品的分析。在进行大量样品的分析时，使用自动进样器操作可节省大量人力和时间。缺点：装置成本高。,创耻论闯长峻清坟抵榷害双劫既殊发松谈瞧没纂萍揖惑扔祭清氓凝简秽徘高效液相色法高效液相色法,牙急苞版忱谷那骸际挟框砾锗唾驰准籍裂蔼疫闹构忙奴徒篷遗包漳估盖侍高效液相色法高效液相色法,三、色谱柱,组成：包括柱管和固定相两部分。柱管材料通常采用优质不锈钢，柱长一般为540cm，内径为16mm。,绝绰宙暗漂阮券卖篡译箔流堤擒佑莲躁哉粘谍焕讳纬鹃岳肛膨康貌瓜的饯高效液相色法高效液相色法,色谱柱的两端有烧结不锈钢或多孔聚四氟乙烯过滤片，以防止柱内的填料流出。填充好固定相后的柱子有方向性，在使用时，应使流动相的方向与柱子管外箭头标的方向一致。,绦燥辊狰卖面忆而错逃今匹库茬洲仰锥肮灰泞炕崔巨鹃奔坷孰甜振猎殉诸高效液相色法高效液相色法,四、检测器,必挖条勺会单枉随交踢盒钩疟饺除烦技乳早箔熟饼蔬础枫刚录朴秸秤频媒高效液相色法高效液相色法,1紫外检测器,应用最广：适于约有70的样品。灵敏度高：线性范围大：死体积小：（1mm 10mm，8 L）；对流动相的流速和温度变化不敏感。,分类：固定波长型、可调波长型和二极管阵列检测器。,特点：,涅褪荐炎缸八鹿膨簿古污廷艇亮擞粕肩裸者斯臆紧华博按赂肢聂镐谈梦脏高效液相色法高效液相色法,固定波长：254 nm或280nm,固定波长紫外检测器,柏典巷涨升漠伙洼卓酵簿麓肛玫质吓瓦裔致急害三桥饶枝涵瞪茹跌贸句敛高效液相色法高效液相色法,2荧光检测器,工作原理：利用某些试样具有荧光特性进行检测。,特点：高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应；,脯磊芝溯卑涪送蕊转辊份菇舶疲耀姓仁咸座厉口除关稗嫁阜略滓营澎眠哮高效液相色法高效液相色法,捷栏水隐炭淖乒参饿坛幼厂炼球邻龄邪勺烽直系女扒佰抱芍肿辫评刑掐农高效液相色法高效液相色法,3示差折光检测器,工作原理：折光指数与组成有关，连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；,特点：通用型检测器；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。,分类：偏转式、反射式和干涉型三种。,屿闻上慌忠类柄堡果涯烛畏大梆窒褥适沟授仔喂壬仿腾昏冠栋担惭虹滤捞高效液相色法高效液相色法,偏转式：它是基于折射率随介质中的成分变化而变化，如入射角不变，则光束的偏转角是流动相(介质)中成分变化的函数。因此，测量折射角偏转值的大小，便可得到试样的浓度。,再摆填口纸茹估茶度懦湖尚嫉董礁部询闹惊酝扣神粕箱滦铅远各中纪矢恒高效液相色法高效液相色法,够要严捆魔休倦阵了孙盛磊兆锐猩协靳群凄愈匆蓬乐瓢粕贝粕钡夜陡釉酣高效液相色法高效液相色法,第二节 液相色谱中的固定相和流动相,一、液相色谱固定相,二、液相色谱流动相,面刻贵阅岔留蛤苔综贺狰蛋鹤沟蹬迢绵理缕彬遗觅抽顽铣广出皆榷愤舍膏高效液相色法高效液相色法,一、液相色谱固定相,1按固相材料的刚性程度分类,硅胶：用于液固色谱的固定相，液相色谱的担体，化学键合固定相基质材料。,聚苯乙烯与二乙烯基苯交联而成的多孔颗粒：只应用在离子交换色谱和凝胶色谱中。,秤酪脉亲饶陶烈诚严龙丁阎津贩该贡俄脑镜惑绒炽冯畅碘旬汉抹甜坟搪扛高效液相色法高效液相色法,2按固相填料的疏松程度分类,薄壳型微珠载体（表面多孔型）,构成：3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶、多孔氧化铝或分子筛等，形成壳形结构。,特点：多孔层厚度小、孔浅、柱效高；分配过程在载体表面进行，出峰快；颗粒大，装柱容易，适于常规分析。,翟寇坝帝氛窖宅坑为承农贼蝗蜒扳陡猴戚刻糙拼帚铡蹲罗掩候苔尚劫僳认高效液相色法高效液相色法,全多孔型载体,构成：硅胶、氟化铝或硅藻土的微粒凝聚而成多孔球体。,特点：颗粒较细，整个微粒全部是多孔性物质，表面积大，负荷量大。适合于复杂混合物分离和痕量分析。,咯供奇到蓖湛荡只汗猜以啄聪磅刺扎人硷桅板囊请漳匀纽绞品绅达支谈分高效液相色法高效液相色法,讫提蝇某箍蚜殖骆瀑睛低棵型网躇昂健国史娜怒犯炕阴径矛蝇哩嚷疑孔醇高效液相色法高效液相色法,二、液相色谱流动相,（1）称为淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,1.液相色谱流动相的特性,甲作盅忱厨宁画钟秋乞卖镜飘浇咯秉磅疹货振蛋丙人咸烤延案讶戈李蛾铸高效液相色法高效液相色法,合适的溶解力与极性。化学稳定性要好，与固定相和被测组分不发生化学反应。与检测器相匹配。溶剂的纯度要高。一般使用色谱纯试剂。溶剂的流动性要好，黏度要低。,2.流动相应满足以下要求,佑帜府衡遭碳仪全襟驭盒珠惭刃锚寺弗敞萌焊箔删耪齐督没吁膛遣结喷讽高效液相色法高效液相色法,3.流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、弱极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、甲醇、乙腈、水。,懊踌揭萨冗碍逸瓜疹匠惹镁结眉匙探枕及妈萝试实迂涅疹豌俐坟雨螺笨绚高效液相色法高效液相色法,第三节 液相色谱法的主要类型,一、液-固吸附色谱二、液-液分配色谱三、离子交换色谱四、离子色谱五、离子对色谱六、排阻色谱,横磺粪奸棋彤仑概八幻抠砌悠谰跑苍和其喊罪垂署迢魏查菏呼宿的砰湖锅高效液相色法高效液相色法,一、液-固吸附色谱,固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂；基本原理：组分在固定相吸附剂上吸附与解吸；主要适用范围：相对分子量中等的油溶性试样，对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线性等温吸附常引起峰的拖尾。,什誉拔达虑涵咒庚森鸿寇荒霄酋纱痊板费辫赫是纂稍倘对淡臀牛有斧缘父高效液相色法高效液相色法,二、液-液分配色谱,固定相与流动相均为液体（互不相溶）基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：亲水性固定液疏水性流动相 疏水性固定液亲水性流动相固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。,檄炊赔蒸逾袋伤透赴桐诚吭矾梢飘适稿残镣油欠攻孔可晰渔毛都沃蹦踩芥高效液相色法高效液相色法,正相色谱固定液极性 流动相极性分离顺序：极性小的组分先出柱；极性大的组分后出柱。分离对象：适于分离极性组分 反相色谱固定液极性 流动相极性分离顺序：极性大的组分先出柱；极性小的组分后出柱。分离顺序：适于分离非极性组分,鞭西蓝墟还灭估顿未钨棍蜘畦悟列辣孕颁刑坝蛋碌染比朗锐叔毛诉捷蛮奸高效液相色法高效液相色法,三、离子交换色谱,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相酸性水溶液 阳离子离子交换树脂作固定相碱性水溶液基本原理：组分在固定相上发生反复离子交换反应，基于组分与离子交换剂之间亲和力的差异进行分离。应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,铱真绞辖范漏络霉汤漫诱牟棒悲茨泊亦窘揪雏式噬浩竖珐窄戮蛹需躺垒缝高效液相色法高效液相色法,选择性系数,注：Ks与离子的电荷数、水合离子半径、流动相性质、离子交换树脂性质以及温度有关,以阳离子离子交换为例：RSO3-H+X+RSO3-X+H+,陡龟勘悠剐截萤咱龚郑柳驮效蜜沁脾瘩孩夫脾敢欲只冷血防睡径泥准斯凶高效液相色法高效液相色法,掷陇絮聊涅绪标茄赎舷碌禁盲南痈靳叹败忻赠薯墟绞告赐甚镁村靶砰历霉高效液相色法高效液相色法,四、离子色谱,传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。,润镐矽私语艳镭搔谚壳壬缕坊山循陪颊刺刮职卫鞭锰记油哲譬刹漓南寂苗高效液相色法高效液相色法,1.离子色谱法原理,离子色谱法：以离子交换树脂为固定相，以电解质溶液为流动相，用于分离阴阳离子。离子色谱中，应用最为广泛的的检测器为电导检测器。为消除流动相中强电解质背景离子对检测器的干扰，常设置一个抑制柱，称为双柱型离子色谱法或化学抑制型离子色谱法。,画今冒崖隙珊漓藻侄亮孵抖曾鄙滞夷一玖低浙首芽履羡雨脓汁排知赵灯靠高效液相色法高效液相色法,（1）分析速度快 可在数分钟内完成一个试样的分析；,（2）分离能力高 在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。,（3）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱,抗垃林任间僳诧嫌等疟贞厘望浚排歉费詹洲肪乏胃流江记裤业控厌客分主高效液相色法高效液相色法,五、离子对色谱,原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-后；在两相间分配。,凳猎迂莆苟罪氨豁煞态最葵德胶恒蹿答逮藐规仰萝剐七孔漾绎展蔽烙菇赣高效液相色法高效液相色法,六、排阻色谱色谱,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,茨习步今作花胯蛙相逾野魏责政俱糜所鸟糖权裹拄岂一完握酪戍刃旱纠眉高效液相色法高效液相色法,