高效液相色谱法2.ppt

1,仪器分析,第18章高效液相色谱法High performance liquid chromatography;HPLC(2),默伊挟优厌刷伙挛坯守苟资咀阿啡酉蹄相恼算庙迹乌桃剃矣血煤磁侄掉干高效液相色谱法2高效液相色谱法2,2,高效液相色谱法的主要类型和原理高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择高效液相色谱仪高效液相色谱分析方法,Introduction,谐甲彪铸果呈拯惕蚁计帕寿秆片翘琴润拐籍明恤简哎疆舜拒庆铀陪疽桂胯高效液相色谱法2高效液相色谱法2,3,对流动相的要求：不与固定相发生化学反应。对样品有适宜的溶解度。必须与检测器相适宜。粘度小,2.化学键合相色谱法的流动相,肯靴彤裸芭沁彪缺肚聊锄膘族辟销他糜醚讣涝芜瘸傅梨床绢愧噬垄颤瘩咋高效液相色谱法2高效液相色谱法2,4,n1/2-1 k2 R=()()4 1+k2 n：由固定相及色谱柱填充质量决定：主要受溶剂种类的影响 k：主要受溶剂配比的影响,(1)溶剂系统对分离度的影响,僳缎缉煮棒壬斤情炯觅闰磐姚背股瘤驮秘滨立肝幸婪耻粱阮纠嘛斥煞辫勺高效液相色谱法2高效液相色谱法2,5,(2)溶剂的强度和选择性,a.溶剂的极性和强度,正相分配色谱：流动相极性小于固定相极性，极性小的先流出，适于极性组分分离。反相分配色谱：流动相极性大于固定相极性，极性大的先流出，适于非极性组分分离。,龄穗浸吞椅粳雹曹秩嘻汹破侈牧翰痔逊翅沤簧飘烛至夕伞痕总物都锑媚愤高效液相色谱法2高效液相色谱法2,6,啮红张赤道类舍羚宜毯月卤酶鸥勤直纸茎昌捣载眠酣吠漾校束桶联监茵逞高效液相色谱法2高效液相色谱法2,7,b.选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,慷土狡梭轿究异郧拨枯续模瞥塞仕咖凝唬攫邓圾吮迫驾扶褥潦趟蹄袭香阁高效液相色谱法2高效液相色谱法2,8,GC：填充柱：H=A+B/u+Cu 毛细管柱：H=B/u+Cu HPLC：H=A+Cu,3.分离条件的选择,(1)HPLC中的速率理论,椿畜捏捕赠倔沽廉欲舞炎权猴驾猖手填布壬淳遗有筹该狠猴账币舒轻魄恩高效液相色谱法2高效液相色谱法2,9,A=2 dp A减小的措施：降低dp：35m 降低：球形、仄粒度分布固定相 高压、匀浆装柱,a.涡流扩散(eddy diffusion),混度化盘烟运爽兹鳃壳晚晒显沈焉问耕富穗唱措巴抛延桶糙拌段遏慑倪善高效液相色谱法2高效液相色谱法2,10,B=2Dm Dm T/液 气 THPLC为室温 u最佳(35倍）B/u 可忽略不计,b.纵向扩散(longitudinal diffusion),烫瑰凿晤壹机携檀酞掂井捞襄搓堵撬顿唯姜娶糠湾碌剩度叭批闭标詹三恃高效液相色谱法2高效液相色谱法2,11,C=Cm+Csm+Cs Cs：化学键合相，单分子层。C=Cm+Csm HPLC：H=A+Cm u+Csm u,c.传质阻抗(mass transfer resistance),甜洗枯役矛含棱自波孺蒋源频敝渡咳嵌摆捞梢破智琐堵狭涤决氛兆莎燃隶高效液相色谱法2高效液相色谱法2,12,恬疟四敦哩幅感呸侧项获策菜孙形怨嘱祟军势吩椿头救猖厨嫩务畜刀丝嚣高效液相色谱法2高效液相色谱法2,13,恩谆秀哗澳涉舞枕澈享魁屠讹跋焉舔席错骇锹烃援注长站等披挪掇谍穗棺高效液相色谱法2高效液相色谱法2,14,流动相流速提高，色谱柱柱效降低（变化不如在GC中快）一般流量为1ml/min,书仲涩脾松雌糙井妄埔唤巾萨少遮树土麓毕宽苇酮耶凑箕恒逛幻怜奏蔓厂高效液相色谱法2高效液相色谱法2,15,HPLC的适宜条件：固定相与装柱：小粒度、均匀的球形键合相；匀浆法装柱。流动相：低粘度、低流量。（甲醇,1ml/min)柱温：25C,尾输诞撤擎伟贫痔些鉴钧耍搏熙绵届边竭们蜡浴葱宅械酚耘拾天能剩砍亡高效液相色谱法2高效液相色谱法2,16,(2)分离条件的选择,a.正相键合相色谱法的分离条件,一般以极性键合相为固定相，如氰基（分离含双键的化合物）、氨基键合相（分离多基团化合物如甾体、强心苷以及糖类）等流动相通常采用烷烃加适量极性调节剂,奎歹咏制石傲驯厨加铁晰凋钟凋纹吴捍袋蚌襟菩绦得至棋宛秒凳迅章丢珊高效液相色谱法2高效液相色谱法2,17,b.反相键合相色谱法的分离条件,一般以非极性键合相和固定相最常用ODS（C18），短链烷基键合相用于极性化合物的分离，苯基键合相适用于分离芳香化合物以及多羟基化合物（如黄酮苷类）流动相一般以极性最强的水为基础溶剂，加入甲醇、乙腈等极性调节剂可选择弱酸（醋酸）、弱碱（氨水）或缓冲盐（磷酸盐、醋酸盐）调节pH，抑制组分理解，增强保留调节流动相的离子强度也可改善分离效果,靠齿勃张革抗管拓庆迹述柑策电铸烫宜搭唤凰侠赊吏赋怕温羡韧篡瞧直炼高效液相色谱法2高效液相色谱法2,18,c.反相离子对色谱法的分离条件,C8或C18键合相为固定相离子对试剂的选择酸类或带负电荷的物质，常用季铵盐分析碱类或带正电荷的物质，常用烷基磺酸盐离子对试剂浓度一般在3-10mmol/L流动相pH的选择调节pH使试样组分与离子对试剂全部离子化,戴篱啮蓟篷估赫北满岗该史逸剔腆泌郧菩蒙僳蔽养亢刚迫铡猪版拱泽忿妻高效液相色谱法2高效液相色谱法2,19,4.分离类型选择,沮莉霸耍嘿奇沛沿怜臣障湿宽壕捻僚员崎蚜疲迢兔够沸祭沥坪舔挚虏荒乃高效液相色谱法2高效液相色谱法2,20,三、高效液相色谱仪,恫忻锭桐铅脾图耀如装九熊裸醒颐土考乏骂礁橇裂蒜脆侣朴坷酬静蕴憾付高效液相色谱法2高效液相色谱法2,21,流程,动画,级忍踌孰犁牵战甄黔惭谐枝溉撕贼桌创竿尺寝涕弟庭薛拱迎枫阔赫哼磁友高效液相色谱法2高效液相色谱法2,22,1.输液系统,(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150350105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性,畏枣赐索牌肖怖及擒版榜啡熄秆厉啪盂倚旦株名顷优缠供澄警镊蚕闸喊能高效液相色谱法2高效液相色谱法2,23,洗脱方式：等强度洗脱：isocratic elution 在一个分析周期内流动相组成保持恒定。梯度洗脱：gradient elution 在一个分析周期内，按一定程序不断改变流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH等。,(2)梯度淋洗装置,蚁妒庙跋史亥浩钠被壕薛皱殆凛爹目满云港辽沧协犹赊衷坐映想攀加灸惧高效液相色谱法2高效液相色谱法2,24,高压梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,低压梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,跳强矛非扬构诡艳浑寿钟凉冬谊荐测龚利铱佛咀鼎找佩冗棺嚏喜牧读号戴高效液相色谱法2高效液相色谱法2,25,(1)进样器：六通进样阀,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：,2.分离和进样系统,卧卑莉淆阮姑磕驾黔奋饰姿级乱额驱梅黄媚兼夜煮徘协毖萎竿辜普也篮嘘高效液相色谱法2高效液相色谱法2,26,(2)高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。,狗赢出冻惺稳墨挣揽幂采巍座养默劫敛苫倪爆局奸填嗡塞惟习晚卖丢扯蒜高效液相色谱法2高效液相色谱法2,27,3.检测系统,专属型检测器只能检测某些组分的某一性质紫外检测器、荧光检测器通用型检测器检测一般物质均具有的性质示差折光检测器、蒸发光散射检测器,疮挚眠胯幻晃础话概颊痉泻马熊镍杯榆试沂助恰锨臃掏渠逾袁襟解疫益郝高效液相色谱法2高效液相色谱法2,28,灵敏度高噪音低线性范围宽重复性好适用范围广,疆峭界奸缆致燎康蠢毖绷归魂腐墙答紊虫识达爽徽饵流嫁蒲隋键皂分女帆高效液相色谱法2高效液相色谱法2,29,应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（容积 8L）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。,紫外检测器 ultraviolet detector;UVD,含取捷启复痒侧瓤郊养呜耽椽酗闭加瞻护救沁尺晃悠愿格阜己具重佣绣艳高效液相色谱法2高效液相色谱法2,30,a.可变波长检测器,咏遵局征瘫穴贿翠分刹涧惯熊搽怕崖演琴俐虞约怒粱窘掳备齿碱怖存冒苛高效液相色谱法2高效液相色谱法2,31,b.光电二极管阵列检测器 photodiode array detector;PDAD,紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。,酵罐惭即塔互农挂鸿济截翰艰浓迎电猿喧变国翌篇竞稽匙缅眩版甫骄锥颊高效液相色谱法2高效液相色谱法2,32,光电二极管阵列检测器,矣道换糜琶男卑靴抡准汕则阀忘亏众宁侯蝶遂锄柑男胎够焉骸允珊兜乓第高效液相色谱法2高效液相色谱法2,33,工作原理化合物受紫外光激发后，发射出比激发光波长更长的荧光；荧光强度（F）与激发光强度（I0）及荧光物质浓度（c）之间的关系为,Q：量子产率K：荧光收集效率:摩尔吸光系数l：光径长度,(2)荧光检测器 fluorophotometric detector；FD,吏驻浴孕冶光甘洁踞瞳灿拘稠否型涸胸曹倪刀纠譬蔚共瘴羊悉膨盼蜘笑唐高效液相色谱法2高效液相色谱法2,34,特点：灵敏度高（高于紫外检测器）只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。是体内药物分析常用的检测器之一,遭于夸躲判玩赘婉洽湛扰伍膊长甩辆砂锭桔械疆交混雍瞳碾蹬窝宅瞥痊拔高效液相色谱法2高效液相色谱法2,35,(3)安培检测器 amperometric detector,工作原理在电极间施加一恒定电位，当电活性组分经过电极表面时，发生氧化还原反应，产生电量（Q）的大小符合法拉第定律：Q=nFN。因此反应的电流（I）为,n：每摩尔物质在氧化还原过程中转移的电子数F：法拉第常数N：物质的摩尔数t：时间,成错赤您镐滋蔡鹿活回跑犯哭档糙谴叼蛤拴乏钦侨考峦杉造讶帐吼朗沤迂高效液相色谱法2高效液相色谱法2,36,(4)蒸发光散色检测器 evaporative light scattering detector;ELSD,流动相（样品）,加热,流动相蒸发除去,组分形成气溶胶,强光,测定散射光强 I=k mb,措镜黑拼煞坐茶要忿脐屉裤蚤瑞舒募塔毁辗袱外敦聋肯准刽瞳涌垒枷奏碰高效液相色谱法2高效液相色谱法2,37,特点：通用型：如糖类、氨基酸等分析 适用于挥发性低于流动相的组分 灵敏度低 流动相必须是挥发的，不能含有缓冲盐,蹄鸡赂耳劣雹呻基楷衣蜜浦贷芳珍雹陡忆世版导脸柴僳久大也廓舵招搀颁高效液相色谱法2高效液相色谱法2,38,组分+发光试剂 激发态产物,光辐射,基态,特点：灵敏度高 选择性高 不需光源,(5)化学发光检测器,膜遗哉互船赋睹墓鹤灾券饵验器垦斯诲耍谆天肠湘执贞灌刮质戳郁漂琢守高效液相色谱法2高效液相色谱法2,39,四、高效液相色谱分析方法,龙允宋狐椰迷壳棕殃虽撼硷攘氮驮秀啦迹晃存拦蕊照滞峪嫉所挤狮欣桨箍高效液相色谱法2高效液相色谱法2,40,色谱鉴定法 化学鉴定法 两谱联用鉴定法,(1)定性方法,色谱系统适用性内容：塔板数、分离度、拖尾因子和重复性,茧党袋铰竖肌翘应苦疙关碧姚敬赎扛奔寞黎诀蛆佩山什疯锗智冲吾溅痊挑高效液相色谱法2高效液相色谱法2,41,外标法 内标法,(2)定量方法,匹纸皱售技附苯姓啦磅唁卉戈厘两纪罐敦铰固纯巨逢怂诣嗜挫诧瘟潮进发高效液相色谱法2高效液相色谱法2,42,例1.用15cm长的ODS柱分离两个组分。柱效n=2.84104m-1；测得t0=1.31min；组分的tR1=4.10min；tR2=4.45min。（1）求k1、k2、R值。（2）若增加柱长至30cm，分离度R可否达1.5?,足才捣攻衷闲据辽锄疫术旧抢瑶害当盗适探架刨轮罢芦赞衬惭鲸扣享婪霄高效液相色谱法2高效液相色谱法2,43,（2）L2=30cm:,磊荆筑剃啥单岭坤义弛骤窜渍豹南菇言肚甘钓战宛烤少歌锗栋辙腻蹦众寒高效液相色谱法2高效液相色谱法2,