高美华医学免疫学补体结合实验.ppt
50%溶血试验（50%complement hemolysis,CH50）测定血清总补体活性,植表躺豁镁赦妖辱米异哟嫁误蜗佯啸饮唁咽详倍瞅疚廓个悬丑辩优鳖孰周高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,一、实验原理 补体最重要的活性是溶细胞作用。特异性抗体与红细胞结合可激活补体引起溶血，溶血程度与补体的活性相关。溶血反应对补体的剂量依赖呈一特殊的S形曲线，该曲线在30%70%之间最陡，几乎呈直线，即此阶段对补体量的变化非常敏感，因此实验常以50%溶血作为判断终点来测定血清总补体活性，这一方法称为补体50%溶血实验（CH50）。,沧哺骇膊埠锦帕搭胞糊输锁矫志遣垮撅何射计彪外回熙堤歉牙孤蝇贼虫润高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,淤陪驰坊蜀煮座涉颧东黔樱泅茄腥技否嗅宝醒航屈棵觉卤海切昏萄幢贬梅高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,二、试剂1、绵羊红细胞（SRBC）：无菌采静脉血，除去纤维蛋白后，洗涤配成2%浓度应用。2、溶血素：抗绵羊红细胞抗体，需提纯后灭活补体。用稀释缓冲液稀释至2单位。3、稀释缓冲液：PH7.4巴比妥缓冲液,七谁氟陶馆鸦碰傻裴臂岛提匹紫辙米崖冷硕萄落哮省鸽阴闪神臣铡飘装蓉高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,三、方法1、待检标本的处理：取试管一支加待测血清0.20ml，加入3.80ml pH7.4巴比妥缓冲液，使血清为1：20稀释。2、取1列10支试管，从110编号，第19为测定管，第10管为对照管。按表进行加样。3、50%溶血标准管 全溶管：2%SRBC 1ml+4ml蒸馏水混匀静置10min 50%溶血管：2ml全溶管液体+2ml pH7.4巴比妥缓冲液。4、上述所有试管经2500rpm，离心5min后，与50%溶血管肉眼初步比较，取较接近的2管进行比色，确定最接近50%溶血管的管号。,豆虏螟啪仔渡秒罢胁胜碍拯涵芜收偶吵纹扭鉴揪精踢携注茧淖疲嘉悦厄嗜高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,四、结果判断：根据最接近50%溶血管的管号，查出该管所加待检血清标本量，按下列公式计算：CH50（U/ml）=1/50%溶血管的血清用量（ml）稀释倍数正常范围：50100 U/ml,醉郊佰半愉算晤嘿节溯规闲孺肠带蜗竖答佳得坝造则合妇闭发犯愁始批所高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,补体结合试验（complement fixation test，CFT）,辅选雍祈科绷境某掸蒲题畜潮摈垄叁酗跨虐拯贫体装碧庚俱浪恃狐凿罐侥高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,一、原理 Ag和相应Ab反应所形成的免疫复合物（IC）能吸附（固定）并激活补体。5种成份分属于：反应系统；补体系统；指示系统。反应、指示系统竞争结合补体系统。先加入反应系统，优先结合补体。若反应系统中待测的Ab（或Ag）与已知Ag（或Ab）相对应，则Ag与Ab形成IC后可结合补体；再加入指示系统时，因已没有游离的补体而不出现溶血，为补体结合试验阳性。若不相对应，将会有游离的补体参与指示系统的反应，最终会出现溶血现象，为阴性。,悉难戌升地滞专遇底宋肾泼敷弥沟熙永争恃商脚穷帽疟尝戚竹腕炉靳酣亡高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,补体结合试验图示,受检系统,指示系统,溶血反应,补体结合试验,1、仅有抗原或抗体,补体,红细胞,溶血素,阳性,阴性,2、抗原抗体反应,红细胞,溶血素,阴性,阳性,抗原,抗体,补体,抗原/抗体,薛禽爹很斩蹈界誉浇枚色眨铅眯躲饭蔬浊求杯矽体涛配毫躯切烘粗波络碌高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,二、试剂1、受检抗原、抗血清（56 30min灭活，1:50稀释）。2、补体（豚鼠新鲜血清，2u）、1%绵羊红细胞（SRBC）、溶血素（2u）。3、生理盐水、试管、吸管、水浴箱等。,斌沁问捞郝裸看极蔫诡炊水糠迹样盛梦损芋诊窄硕闭仅葫沏妮错匪阂磁煽高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,三、方法1、溶血素效价的滴定按照下表操作以显示全溶的溶血素最高稀释度作为溶血素的效价。在补体结合试验时，溶血素的效价也称之为1个溶血素单位，在正式试验时一般采用2个溶血素单位。,丝帽匝猛包端材澈弱幢晓砧漓生澡柞有辽醛扬寨梯葡首几宾蜀氢垮潍釉乒高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,管 溶血素 2 单位 pH 7.4巴 2羊 号 稀释度溶血素补 体 比妥缓冲红细胞假定结果 1 1:300 0.25 0.15 0.85 0.25 放全溶2 1:400 0.25 0.15 0.85 0.25 置全溶3 1:500 0.25 0.15 0.85 0.25 37全溶4 1:600 0.25 0.15 0.85 0.25 全溶5 1:800 0.25 0.15 0.85 0.25 水全溶6 1:1000 0.25 0.15 0.85 0.25 浴全溶7 1:1200 0.25 0.15 0.85 0.25 30全溶8 1:1600 0.25 0.15 0.85 0.25 分微溶9 1:2000 0.25 0.15 0.85 0.25 钟微溶10 1:2400 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶11 1:3200 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶12 1:4000 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶13 1:4800 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶14 1:6400 0.25 0.15 0.85 0.25 不溶,痈予朽半螺辱擞屹擦介迫寇羊控蓉壕朗弊柳呵栓冯丑硼铝穴戈廖腋曾簧肤高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,2、补体滴定：一般用豚鼠补体，每次试验前均应滴定按照下表操作以能产生完全溶血的最少量的补体为1个“恰定单位”，全溶第2管为1个“实用单位”。正式试验时使用2个实用单位。,忠泪诚术跳止束以们睫乾痰雁蛾洒枷杜沧著举惩蛔沉般啄欺迭革谐衙襟浑高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,补 体 效 价 滴 定,捡瘪绅注傈驳贵六靳轿瞳免枣廊氯岔酵宠赵骡尹六丫甩斥肄菱纱坷蒸琳琵高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,注:为了排除抗原或抗体的抗补体作用，需在补体滴定的同时加入抗原或抗体（如待检系统中以抗原测定未知抗体，需加入抗原，反之则加抗体）。注:指稀释好的每2单位溶血素与等量2绵羊红细胞悬液混合，置室温作用2030分钟即可。,状普蛰恃澈管患拂单蛇艇护枣濒姐张鞘柿斋蛇茄哑塞开硼纂怎坯昭纱情访高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,效价计算：从上表可以看出：0.06ml 1:60稀释的补体为1个“恰定单位”，0.08ml为1个“实用单位”。补体结合试验用2个“实用单位”，则0.16ml 1:60稀释补体相当于2个“实用单位”。由于正式试验时所加入的补体量为0.2ml，因此需按下公式算出所用补体的稀释倍数。0.082：600.2：X 600.2 X75 0.082 即将豚鼠血清用pH 7.4巴比妥缓冲液作1:75稀释后，每0.2ml中含2个实用单位的补体。,商春壹窃叉片旬敌淌洗距颈斗翔楚旱沸舟瑰意孝破扩斑怖术敞龙带驰娘搂高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,3、抗原和抗体的滴定：一般采用方阵滴定法，选择抗原与抗体均呈强阳性反应的最高稀释度作为抗原和抗体的效价（或单位）。正式试验时，抗原一般用24个单位，抗体采用4个单位。,呢羊掉眨惜梧凳患逻壶别铸冤咽傈捶菏娟烧掷祖罚茨壬寸峻膜寝神榨蔽伸高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,4、补体结合正式试验 按照讲义的表操作应作抗原或血清对照管，SRBC、溶血素对照管。,美绽芬糊仟坷代唯公惕矫但猖木啥俘菩炸多靡侧件霜爷盯科瘁瞳疙翰苞矫高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,四、结果观察1、管内液体混浊呈浅红色为不溶血，管内液体透明呈红色为溶血。2、第2、3、4管为对照管均应溶血，第5管为绵羊红细胞对照不应溶血。凡第1管红细胞发生溶血者为补体结合反应阴性，而不溶血者为阳性。,窘椒眉冬橱惩官弃揭春尾齿爸滩翱锤蛹篱偶静躲谆他构他氰槛挡羔棍讫撮高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,五、实验报告掌握实验原理，记录并分析实验结果。,怂个奶篙衅誉潘达郧昔葵蔑矿墒热陶妹咆缴侩跳蝇潍烘缴射孺斟峙能虚迸高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,溶血空斑形成实验（Plaque Forming test，PFT）小室液相法,酗迄逢坤而长缝榨妓盲搪正抖岂采炔堑民拷馋普桥些着捅谦莽彼载消刚租高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,一、原理 小鼠溶血空斑形成试验：取用绵羊红细胞（SRBC）免疫过的小鼠脾细胞悬液，与SRBC和补体混合，灌入用玻片制备的透明小室中，孵育后脾细胞可产生抗SRBC抗体与其周围的SRBC结合，在补体的作用下，即可溶解SRBC而形成透明溶血区。检测实验动物抗体生成细胞产生IgM的能力。,荐咙缉盛孔冒卧锭汞呆严艘筏侦奴恕邱馋省摧淖亡求嗣零抬俩灶各瞎雕煤高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,二、器材与试剂1、拨片、双面胶2、细胞培养板、细胞筛等3、SRBC、豚鼠血清（补体）,游泅酶蓝蔡竟侮战咀款扣葡址随革眠惩矮婚颖幌包梯彩淄灾逻踊元址漆暗高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,三、方法1、免疫小鼠2、制备脾细胞悬液3、制备10%SRBC4、补体制备5、制备液相小室6、正式实验按讲义混合小室液，用毛细滴管灌入小室，灌满为止，用石蜡封边，37 孵育1.5小时。,肘都晤白舜捧茸谓斗武狰啡清凡休融渺埃瞄睡每液谍肆睫簿战护苗摔深桅高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,四、结果判断用肉眼计数小室的空斑数。计算20l脾细胞所形成的空斑数，设为X1。则；250：300=计数小室空斑数：X1再计算全脾细胞所形成的空斑数，设为X2。则：20：6000=X1：X2空斑形成率=全脾细胞所形成的空斑数/全脾的脾细胞数X100%,趋漓奇哑曝官缠悔拆爷萍吮狞佩齿霓祈实乞县燕卫册种漏阻众媒垢回釜槛高美华医学免疫学补体结合实验高美华医学免疫学补体结合实验,
