BCL6MYCCCND1IGHBCL2IGH基因探针试剂荧光原位杂交法说明书.docx

BeL6MYCCCND1IGHBCL2IGH基因探针试剂(荧光原位杂交法)说明书【产品名称】通用名称：BCL6MYCCCND1IGHBCL2IGH基因探针试齐IJ(荧光原位杂交法)【包装规格】5人份/盒、10人份/盒、20人份/盒。【预期用途】在常规染色基础上进行原位杂交染色，为医师提供诊断的辅助信息。【检验原理】荧光原位杂交法(FluorescentInSituHybridization,FISH)能够使细胞中特定的核甘酸序列清楚的呈现出来。荧光标记的DNA探针能够与目标序列结合发出荧光，杂交之后的DNA片段能够直接在荧光显微镜下观察到。经过10%中性缓冲福尔马林固定、石蜡包埋的组织放到切片上面，DNA首先经过变性成为单链DNA,随后与探针DNA有序结合。结合完成之后，多余的探针DNA被洗涤缓冲液清洗掉，同时，细胞核被特定的DNA染色剂4；6二眯基2.苯基口引咻(DAPI)染色会发出蓝色荧光。杂交之后的探针信号可以在荧光显微镜下观察到。【主要组成成分】由MYC断裂探针、BCL6断裂探针、CCNDl/IGH融合探针、BCL2/1GH融合探针组成。试剂规格主要成分5人份/盒10人份/盒20人份/盒MYC断裂探针50L管Xl管100L管Xl管200L管Xl管荧光标记探针、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸三钠、硫酸葡聚糖BCL6断裂探针50L管Xl管100L管xl管200L管xl管荧光标记探针、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸三钠、硫酸葡聚糖CCNDI/IGH融合探针50L管Xl管100L管Xl管200L管Xl管荧光标记探针、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸三钠、硫酸葡聚糖BCL2/IGH融合探针50L管Xl管100L管xl管200LW×l管荧光标记探针、甲酰胺、氯化钠、柠檬酸三钠、硫酸葡聚糖DAPI复染液125L管Xl管250L管xl管500L管Xl管DAPk对苯二胺、甘油试剂盒中不包含但对该项检测必需的组份：荧光原位杂交样本处理试剂盒（荧光原位杂交法）（备案证号：豫郑械备号，含预处理缓冲液、胃蛋白酶溶液、洗涤缓冲液I、洗涤缓冲液II和胃蛋白酶粉末）其他未提供试剂：二甲苯、乙醇（70%、85%、无水）、去离子水和橡皮胶。【储存条件及有效期】20±5避光保存，有效期为12个月。运输条件：运输温度不超过8,时间不超过一周。【适用仪器】荧光原位杂交仪；荧光显微镜，其中物镜：建议使用100倍消色差浸油类型物镜可取得满意效果。镜油：在浸油式物镜上使用的镜油应为低水平自发荧光配方，并专门在荧光显微镜上使用。滤光片：建议顾客使用探针前向滤片组供应商了解所使用的滤片组的详细情况，以便选择与标记荧光染料相适应的滤片组。绿色荧光：激发波长为496nm,发射波长为520nm0橙色荧光：激发波长为551nm,发射波长为572nm0【样本要求】10%中性缓冲福尔马林固定，固定时间648h,参照病理技术规范要求取材、脱水、石蜡包埋并制成蜡块。蜡块应避免与酸、强碱接触，并避免过热，蜡块应在通风、干燥的专用蜡块柜中储存。【检验方法】一、检测仪器及设备荧光原位杂交仪、荧光显微镜、微波炉、压力锅、离心机和水浴锅。二、检验方法1 .试剂配制胃酶消化液：每50mL胃蛋白酶溶液加入1管胃蛋白酶粉末（0.1g）,并放入37C±1C恒温水浴锅中保温备用。2样本处理及切片制备1.1 样本于常温下在10%中性缓冲福尔马林缓冲液中固定648h,为了达到最佳的和均匀的固定与石蜡包埋效果，样本大小不宜超过0.5Cm3。1.2 标准操作和石蜡包埋，使用高质量的石蜡。渗透和包埋应在低于65下进行。1.3 切成35m厚度的切片。3切片预处理程序3.1 5565烤片3h以上（过夜）。3.2 提前预热胃酶消化液，使其温度达到37°C保温备用。3.3 二甲苯中室温浸泡3次，1Omin/次。3.4 无水乙醇中室温浸泡2次，5min次。3.5 依次85%、70%乙醇中室温处理切片3min。3.6 去离子水清洗3次，2min次。3.7 用微波炉将适量的预处理缓冲液煮沸后,然后使其处于保温状态,放入切片修复20min,或是在压力锅内加入适量的预处理缓冲液，高压修复5min。3.8 取出切片，用去离子水洗涤3次。将切片加入提前配制预热的胃酶消化液中，消化15±10mino注：根据不同的组织（细胞）类型及切片厚度，消化时间有所不同，一般来讲，建议预实验找到样本的最佳消化时间。3.9 去离子水清洗3次，2min次。310脱水依次在70%乙醇、85%乙醇、无水乙醇溶液中各处理2min,晾干。4FISH操作步骤注：荧光基团遇强光会产生光漂白现象。将含有荧光基团的试剂与切片避光有助于减少此效应。所有需避光的步骤均在暗处进行。FISH实验操作过程中请注意防护，试剂勿与皮肤直接接触。4.1 样本变性与杂交4.1.1 将含有MYC断裂探针、BCL6断裂探针、CCNDl/1GH融合探针、BCL2/1GH融合探针的杂交液从冰箱取出，瞬时离心，用移液器取10L至各个样本。滴加至目标区域。4.1.2 盖上盖玻片，避免气泡，橡皮胶封片。4.1.3 将切片放入杂交仪，83变性6min,40过夜杂交。注：杂交期间片子不能干！4.2 杂交后的处理421提前30min将洗涤缓冲液I水浴加热到72°C±1°C,小心除去橡皮胶。422将切片置于洗涤缓冲液11中，放置510min,除去盖玻片。4.2.1 将切片置于洗涤缓冲液1（水浴加热到72°C±1°C）中，上下提拉切片13s,放置3min。4.2.2 室温条件下，将切片置于洗涤缓冲液II中，上下提拉13s,处理切片2min°425在70%、85%的乙醇溶液中依次放置2min。4.2.6 避光晾干样本。注：考普林缸中每次最好同时放置4张切片，当最后一张切片放入考普林缸时开始计时。5DAPI复染液染色、封片滴加10LDAPI复染液到石蜡切片上，避免气泡，盖上盖玻片，-20C避光孵育1020mirio6镜检将切片取出，于荧光显微镜下观察（长期保存应放于-20）。【阳性判断值】计数100个肿瘤细胞，分析样本中MYC、BCL6、CCNDl/IGHBCL2/IGH基因异常情况。针对MYC,当异常细胞数10%时判为阳性，MYC基因发生断裂，当异常细胞数10%时判为阴性，MYC基因未发生断裂。针对BCL6,当异常细胞数10%时判为阳性，BCL6基因发生断裂，当异常细胞数10%时判为阴性，BCL6基因未发生断裂。针对CCNDl/IGH组合，当异常细胞数10%时判为阳性，CCNDl/IGH基因发生融合，当异常细胞数10%时判为阴性，CCNDl/IGH基因未发生融合。针对BCL2/1GH组合，当异常细胞数10%时判为阳性，BCL2/1GH基因发生融合，当异常细胞数00%时判为阴性，BCL2/IGH基因未发生融合。【检验结果的解释】对于BCL6,在正常细胞中，存在两个融合的橙绿信号，提示BCL6基因未发生断裂;在异常细胞中，存在至少有一组橙色和绿色分离信号，提示BCL6基因发生断裂。对于MYC,在正常细胞中，存在两个融合的橙绿信号，提示MYC基因未发生断裂;在异常细胞中，存在至少有一组橙色和绿色分离信号，提示MYC基因发生断裂。对于CCND1/IGH组合，在正常细胞中，存在两个橙色和两个绿色信号，提示CCND1/IGH基因未发生融合；在异常细胞中，存在至少一组橙绿融合信号，提示CCNDl/IGH基因发生融合。对于BCL2/IGH组合,在正常细胞中,存在两个橙色和两个绿色信号,提示BCL2/IGH基因未发生融合；在异常细胞中，存在至少一组橙绿融合信号，提示BCL2/IGH基因发生融合。结果分析注意事项：1 .样本需随机计数细胞。2 .计数细胞必须是各通道信号均清晰可辨的细胞。3 .杂交不均匀的区域不要分析。4 .细胞核轮廓不清或有重叠的不要分析。5 .背景深影响信号判断的区域不要分析。6 .如果超过25%的细胞核内信号太弱，则该区域不要进行分析。7 .如果超过10%的细胞质内有信号，则该区域不要进行分析。8 .计数结果需有两个参与人员独立完成，结果一致方可认定。【检测方法的局限性】1 .本试剂盒只用于体外诊断。适用于患者BCL6、MYCCCNDl/IGH>BCL2/IGH基因异常情况的检测，不能用于其他基因突变方式的检测。2 .本试剂盒的检出结果仅供临床参考，检测结果的临床判定均应结合患者医疗病史和其它临床诊断结果进行综合评估，不能作为临床诊治的唯一依据。3 .检测结果如与细胞病理学特征不符，应核实病理诊断或重新检测。4 .本产品的性能指标是基于说明书所述检测程序获得，对该程序进行更改，可能会改变该检验的结果。【产品性能指标】1 .荧光信号强度探针与外周血培养的淋巴细胞制成的对照片杂交后，在荧光显微镜下，应发出可被肉眼识别的荧光信号。2 .灵敏性在外周血培养的淋巴细胞制成的对照片上，BCL6分析50个处于中期分裂相细胞的100条3号染色体，至少有98条显示一个BCL6基因位点标记的橙绿融合信号。在外周血培养的淋巴细胞制成的对照片上，MYC分析50个处于中期分裂相细胞的100条8号染色体，至少有98条显示一个MYC基因位点标记的橙绿融合信号。在外周血培养的淋巴细胞制成的对照片上，CCND1/IGH分析50个处于中期分裂相细胞的100条11号染色体和14号染色体,在11号染色体上,至少有98条显示一个CCNDl基因位点标记的橙色荧光信号，在14号染色体上，至少有98条显示一个IGH基因位点标记的绿色荧光信号。在外周血培养的淋巴细胞制成的对照片上，BCL2/IGH分析50个处于中期分裂相细胞的100条18号染色体和14号染色体，在18号染色体上，至少有98条显示一个BCL2基因位点标记的橙色荧光信号，在14号染色体上，至少有98条显示一个IGH基因位点标记的绿色荧光信号。3 .特异性在外周血培养的淋巴细胞制成的对照片上，BCL6分析50个处于中期分裂相细胞的100条3号染色体，在3号染色体长臂上(3q27),至少有98条显示一个BCL6基因位点标记的橙绿融合信号。在外周血培养的淋巴细胞制成的对照片上，MYC分析50个处于中期分裂相细胞的100条8号染色体，在8号染色体长臂上（8q24）,至少有98条显示一个MYC基因位点标记的橙绿融合信号。在外周血培养的淋巴细胞制成的对照片上，CCND1/IGH分析50个处于中期分裂相细胞的100条11号染色体和14号染色体，在11号染色体长臂上（Ilql3）,至少有98条显示一个CCNDl基因位点标记的橙色荧光信号，在14号染色体长臂上（14q32）,至少有98条显示一个IGH基因位点标记的绿色荧光信号。在外周血培养的淋巴细胞制成的对照片上，BCL2/1GH分析50个处于中期分裂相细胞的100条18号染色体和14号染色体，在18号染色体长臂上（18q21）,至少有98条显示一个BCL2基因位点标记的橙色荧光信号，在14号染色体长臂上（14q32）,至少有98条显示一个IGH基因位点标记的绿色荧光信号。【注意事项】1 .本试剂盒仅用于体外检测，必须经过严格培训的专业人员使用。2 .本试剂盒实验操作过程中，需戴乳胶手套操作，避免试剂接触肌肤。如不慎接触，立即用大量水冲洗。3 .实验过程中的废弃样本及实验废弃物，需作为医疗废物统一回收处理。4 .为得到理想的结果，需确保试剂按照说明书正确配制，正确储存。5 .使用前请仔细阅读本说明书。6 .实验过程中的常见问题及处理方法（见下表）：问题可能的原因推荐的解决方案无信号或信号微弱样本及探针变性不充分确保切片进行变性时温度在83C±2°C；将切片变性时间延长12min。问题可能的原因推荐的解决方案未添加探针探针充分解冻，短暂离心，确保移液器吸取到探针试剂。探针用量不足确保移液器吸取准确，探针加入量达到IOUL；请不要稀释探针；使用前确保探针解冻充分并达到室温。切片干燥不充分探针滴加至切片前，确保切片上的乙醇溶液已经完全挥发。探针干燥太快探针滴加后应立即将盖玻片覆盖目标区域；进行洗涤时，一次只能移除一张切片上的盖玻片，并且在移除下一张之前立即将切片浸入洗涤缓冲液中。杂交时盖玻片下有气泡形成放盖玻片时要覆盖探针表面，轻轻挤压以便挤出气泡。杂交条件不合适确保遵守杂交所规定的时间和温度；橡皮胶封片时勿留缝隙；根据情况，调整杂交时间和温度。洗涤缓冲液或洗涤条件不正确确保按照产品说明书要求配制洗涤缓冲液；确保洗涤缓冲液的温度达到洗涤步骤所规定温度；切片浸入洗涤缓冲液前移去盖玻片。探针或样本切片储存不正确确保探针-20°C±5°C避光保存；将未杂交切片干燥后置于20°C长期保存或者室温短期保存；将杂交后切片置于-20C避光保存。问题可能的原因推荐的解决方案观察时所选用的滤片组不合适使用正确滤片组观察探针荧光情况；详情请咨询河南赛诺特生物技术有限公司技术支持部门。显微镜构造及物镜不适宜观察FlSH样本，或者滤片组损伤请联系显微镜制造商。玻片背景过强样本制作前玻片清洗不够干净将玻片浸入无水乙醇中，制片前用无绒纸巾擦干。杂交后洗涤不充分确保洗涤缓冲液按说明书配制；确保按说明书操作；确保洗涤缓冲液温度正确；移去盖玻片，重复洗涤步骤。洗涤缓冲液使用时间太长或不正确储存确保洗涤缓冲液2C8C储存，配制7天后或者经常使用的洗涤缓冲液应丢弃。复染过弱复染时间短将切片依次置于70%乙醇、85%乙醇和无水乙醉中各Imin进行梯度脱水后再复染。复染液陈旧或过度光照确保复染液20°C±5°C避光保存；确保复染液未失效。【参考文献】1. GongJY,ZhangYZ,ZhangJD,etal.Clinicalcharacteristicsofhigh-gradeB-celllymphomaswithrearrangementofMYC,bcl-6andbcl-2J.ZhonghuaBingLIXueZaZhi,2018,47(1):14-18.2. MinakataD,SatoK,IkedaT,etal.Aleukemicdouble-hitfollicularlymphomaassociatedwithacomplexvarianttranslocation,t(8;14;18)(q24;q32;q21),involvingBCL2,MYC,andIGHJ.CancerGenetics,2018,220:44-48.【基本信息】备案人/生产企业：河南赛诺特生物技术有限公司住所：郑州高新技术产业开发区翠竹街1号109号联系方式：售后服务单位名称：河南赛诺特生物技术有限公司联系方式：生产地址：1号109号7楼生产备案凭证编号：豫郑食药监械生产备号（更）【医疗器械备案凭证编号/产品技术要求编号】豫郑械备号【说明书核准日期】2019年11月25日【说明书修改日期】2020年5月6日