《食品分析》教案——第十章 维生素的测定.docx

食品分析教案（第17次课2学时）一、授课题目第十章维生素的测定第一节概述第二节脂溶性维生素的测定二、教学目的和要求学习本章内容，要求学生了解维生素的命名、特点及分类，了解脂溶性维生素的测定方法，重点掌握样品处理方法，掌握VA的测定方法。三、教学重点和难点重点：维生素的分类；VA的测定方法。难点：VA的测定方法四、主要参考资料1、穆华荣、于淑萍主编，食品分析.北京：化学工业出版社，20042、周光理主编，食品分析与检验技术，北京：化学工业出版社，20063、杨月欣主编，实用食物营养成分分心手册（第二版），北京：中国轻工业出版社，20074、曲祖乙、刘靖主编，食品分析与检验.北京：中国环境科学出版社，2006五、教学过程1、学时分配：2学时2、辅导手段：自习答疑3、教学办法：讲授4、板书设计：（见上页）5、教学内容第十章维生素的测定第一节概述维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类,有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醒类化合物。一、维生素的命名1、根据发现的时间顺序以英文字母排序：维生素A、维生素B、维生素E等2、根据特定生理功能命名：抗干眼病因子(维生素A)、抗坏血酸(VC)>生育酚(VE)3、根据化学结构命名：视黄静(VAJ、硫胺素(VBj二、维生素的共同特点维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，但都有以下共同特点：1、这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；2、它们不能供给机体热能，也不是构成组织的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；3、它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；4、长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病，但是摄入量过多，超过生理需要量时，可导致体内积存过多而引起中毒。三、测定维生素的意义1、评价食品的营养价值;2、开发利用富含维生素的食品资源；3、指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症；4、研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导制定合理的生产工艺条件及贮存条件，最大限度地保留各种维生素；5、监督维生素强化食品的强化剂量，防止维生素摄入过多引起中毒。补充：维生素知识一：维生素ACE是什么体内生成的活性氧及过氧化脂质是对身体有害的物质，会导致细胞的老化、癌变、动脉硬化、中风及心肌梗死等生活习惯性疾病。维生素A、维生素C及维生素E与抑制活性氧及过氧化脂质的产生、预防癌症、延缓衰老有关。这些维生素的字头(A、C、E)合在一起，我们将预防生活习惯性疾病的维生素称为维生素ACE。维生素知识二：维生素的单位各不相同维生素的需要量很少，根据其种类不同，所使用的重量单位也各不相同。现在使用的单位是毫克(mg)、微克(Ug)两种。毫克在维生素Bl、维生素B2、维生素B6、烟酸、泛酸、维生素C、维生素E中使用，1毫克等于0.001克。微克在维生素A、维生素Bl2、叶酸、生物素、维生素D、维生素K中使用，1微克等于0.001亳克。另外，国际单位(IU)是国际上规定微量维生素的使用单位，目前用于维生素D,1国际单位的维生素A相当于0.3微克，1国际单位的维生素D相当于0.25微克，市场上用药仍以国际单位表示。维生素知识三：蔬菜和水果是否最好连皮一起吃从前以为，无论蔬菜还是水果，皮和果肉都有营养，所以最好连皮一起吃。的确，食品为了保护自己，皮及纤维组织非常坚固，含有丰富的维生素、矿物质及食物纤维等。能够连皮一起吃的，尽量连皮一起吃，对身体又好，垃圾又少，一举两得。但是，现在人们更担心残余农药问题。好好洗一下，如果可以加热的话，充分加热后，就可以基本没问题了。维生素知识五：为什么维生素C的需要量倍增从2000年4月开始，成年人每日维生素C需要量规定为100毫克，是以往50毫克的两倍。维生素C对于充满压力的现代人来讲是必不可少的，压力越大，肾上腺皮质激素的分泌过多，而维生素C与生成这种激素有关。另外，从抑制过氧化脂质生成的功能，到生活习惯病及癌症的预防，维生素C越来越受到大家的关注。维生素知识六：维生素与美丽肌肤维生素C对老人斑及雀斑有利。老年斑一旦出现就没有办法了，但是可以预防它的产生。尽量减少日光的直射，日常生活中注意维生素C的摄取，以预防皮肤的色素沉着。另外，维生素E可以改善血液循环，预防过氧化脂质的产生，对老年斑的预防也有效。同时，也不要忘补充使皮肤润滑的维生素A。维生素知识七：柚子皮和果汁含有较多维生素在日本，从秋天到冬天的菜中，柚子是不可缺少的。柚子做成饮料或者放入面条中，都会一种特殊的香味，不仅如此，还是丰富的微生素C的来源。柚子中维生素C的含量比柑橘类多每100克柚子皮含150毫克，100克果汁约含40毫克。柚子装入保鲜袋中冷冻保存，便于常备。使用时，在冷冻状态直接切一块,剩余部分继续冷冻就可以了。酸橘和蜜橘也一样，皮中含有富的维生素C,要多多加以利用。维生素知识八：能排除毒素的黄绿色蔬菜以二氧化物为首的各种环境毒素，持续污染着地球环境，导致的结果是：随着食物链的延续，污染的程度逐渐浓缩，并随着鱼等日常饮食进入人体中蓄积。这个影响值得担忧。能讲二氧化物排出体外最有效的是食物纤维。由于环境毒素有活性氧的作用，因而有抗氧化作用的维生素也能有效缓解毒性。由此可见，含有食物纤维、叶绿素、类胡萝卜素、维生素C、维生素E等的黄绿色蔬菜对二氧化物的排出是很有效的。维生素知识九：牛肝的维生素A为何锐减肝，无论是牛的、猪的，还是鸡的，维生素A的含量均非常丰富，但最近发现日本市场上牛肝的维生素A的含量仅相当于猪肝、鸡肝的1/10,十分奇怪。原来是因为日本人喜欢吃五花牛肉的缘故，这种牛肉看上去白色脂肪像网眼。为了造成这种效果，饲养场对饲料特殊配置，但维生素A却锐减了维生素知识十：西红柿中的胡萝卜素和菌脂色素欧洲有这种说法：“西红柿红了，医生就青了。”因为西红柿中的维生素C含量高，利于人体健康。西红柿漂亮的红色是胡萝卜素和菌脂色素所致。出地中，成熟的西红柿胡萝卜素含量高，青的西红柿收获后变红则非胡萝卜素所致，而是因为生成菌脂色素的缘故。菌脂色素无维生素A的作用，但可消去活性氧的能力是胡萝卜素的2倍以上，具有抗癌作用四、维生素的分类按溶解性分为两大类脂溶性维生素：A、D、E、K及其各小类水溶性维生素：B、C及其各小类五、维生素的主要理化性质1、脂溶性维生素：（1）溶解性：不溶于水，易溶于有机溶剂。（2）耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定；维生素E对酸稳定，对碱不稳定。（3）耐热、耐氧化性：维生素A、D、E耐热性好维生素A易氧化，因含双键;维生素D不易被氧化；维生素E在空气中能被慢慢氧化，光、热、碱促其氧化。2、水溶性维生素：（1）溶解性：易溶于水，不溶于大部分有机溶剂（2）耐酸碱性：在酸性介质中稳定，在碱性条件下不稳定（3）易受空气、光、热、酶、金属离子的影响。结论：在测定维生素时，要根据其性质控制好测定条件。六、测定方法1、生物鉴定法不用详尽分离，但费时（21）天，费力（要动物饲料）具体来说，生物鉴定法就是利用药效学和分子生物学等有关技术来鉴定中药品质的一种方法，通常分为生物效应鉴定法和基因鉴定法两大类。按照鉴定的目的和对象不同，也可分为免疫鉴定法、细胞生物学鉴定法、生物效价测定法、纯指标测定法、DNA遗传标记鉴定法、InRNA差异显示鉴定法等。免疫鉴定法是利用中药含有的特异蛋白为抗原制备的特异抗体，与供试品种特异抗原结合产生沉淀反应的一种方法，此法可准确地鉴别中药品种。细胞生物学鉴定法主要采用染色体的分类技术对中药进行鉴别。中药某个特定种群的生物体细胞中染色体的形态、组型是稳定不变的，代表该种群的基本遗传特征，根据该特征即可鉴定中药的品种，适用于果实和种子类中药的鉴定。生物效价测定法重点在于测定药物对生物机体某方面作用的强度，如对洋地黄强心指标的生物效价的测定等。此法常采用动物试验方法，如鸽法、豚鼠法等。纯指标测定法就是测定某药物或某类药物某一特性或某一药理作用的强弱，如使用溶血法鉴定柴胡和大叶柴胡。DNA遗传标记鉴定法主要运用分子遗传学技术，如对鸡内金与鸭内金的鉴别，可利用微量DNA提取技术，从测试药材中提取DNA,进行DNA碱基序列测定，最后鉴别出真伪。mRNA差异显示鉴定法是利用中药不同组织或细胞在基因表达上的差异进行鉴定的一种方法。主要通过将总RNA反转录成单链CRNA,然后进行PCR扩增反应，分离出不同分子大小的DNA,挑选出有差异的表达基因进行序列分析。采用该技术可提炼出栽培和野生、道地与普通药材之间的特征，可望广泛用于中药品种鉴定。中药生物鉴定法侧重中药的品质和临床用药的安全性、有效性等的有机结合的研究，可以配合其他鉴定方法综合解决中药品质鉴定的难题，并尝试为中医与中药现代化的结合找到突破口。2、微生物法基于微生物生长需要特定维生素，选择性高，主要用于水溶性维生素，但操作繁琐，耗时过长，要有专门人员。3、仪器分析（紫外法、荧光法等）灵敏、快速、有较好的选择性4、各种色谱法（柱、纸、薄层层析）高分离效能，可分离、纯化、定性、定量5、现代高压液相色谱和气相色谱可同时完成多种维生素及其异构体的自动分离、检测6、化学分析法（比色法）简便、快速、不需特殊仪器第二节脂溶性V的测定一、概述VA.VD.VE、与类脂物一起存于食物中，摄食时可吸收，可在体内积贮。（一）、脂溶性维生素具有以下理化性质：1、溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醛、苯等有机溶剂。2、耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。3、耐热性、耐氧化性：耐热性氧化性VA好，能经受煮沸易被氧化（光、热促进其氧化）VD好，能经受煮沸不易被氧化VE好，能经受煮沸在空气中能慢慢被化（光、热、碱促进其氧化）（二）、根据上述性质.测定脂溶性维生素时，通常：皂化样品一;水洗声除类脂物"整机溶剂提取脂溶性维生素（不皂化由）短缩溶于适W的溶剂测定。注意：1、在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂（如焦性没食子酸、维生素C等）。2、对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。3、国际单位：IU（InternationalUnit）IIU=0.3gVA=0.025Vd=1.79HgB-胡萝卜素=LInIgTE=3HgVB所谓的国际单位（I.U.）是评估维生素A,D两种营养素含量的计量单位。在维生素A方面早期是将0.30微克的视网醇或0.60微克的-胡萝卜素定义为1国际单位，因为在动物实验中，同量的视网醇与B-胡萝卜素生理活性相较，后者只有前者的一半。后来发现B-胡萝卜素的吸收率偏低（只有视网醇的三分之一），而且B-胡萝卜素之外的其他维生素A先质，生理活性还更低。说这麽多是什麽意思？就是说使用国际单位作为维生素A的计量单位，无法反应真实的维生素A的营养价值（植物性的来源会有高估之嫌），因此最新的营养摄取建议，都已利用视网醇当量，作为维生素A的计量单位。1微克视网醇当量=1微克视网醇=6微克B-胡萝卜素=3.33国际单位视网醇=10国际单位B-胡萝卜素与其他维生素A先质（IooO微克=1毫克通常市售B-胡萝卜素一颗约15mg即2500OnJ维生素A）1微克的维生素D相当於40国际单位.二、维生素A的测定维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不合VA,但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA,故称为VA原。维生素A：由B紫罗酮环与不饱和一元醇所组成的一类化合物及其衍生物的总称。包括AI和A2。维生素A1：视黄醇，有多种异构体，可转化成多种衍生物。类视黄素：维生素A?（3-脱氢视黄醇）、视黄醛、视黄酸、3-脱氢视黄醛、3-脱氢视黄酸是维生素A1的衍生物,具有维生素A同样的作用，总称为类视黄素。（一）高效液相色谱法测定食物中VA、VC（GB/T5009.822003中第一法）高效液相色谱法测定维生素A是近几年发展起来的方法，此法能快速分离和测定视黄醇和它的同分异构体、酯及其衍生物。这里介绍的是同时测定维生素A和维生素E的方法。步骤：样品皂化提取浓缩色谱分析（二）比色法测定VA的含量（GB/T5009.822003中第二法）1、原理在氯仿溶液中，VA与三氯化铀可生成蓝色可溶性络合物，在620nm波长处有最大吸收峰，其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。2、试剂（1）无水硫酸钠Na2SO1（2）乙酸酢（3）无水乙醛不含有过氧化物检查方法：取5mL乙醛加ImLl0%碘化钾溶液，振摇1分钟，如含过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色；或加入4滴0.5%淀粉溶液，水层呈蓝色。去除方法：重蒸乙醛时，瓶内放入少许铁末或纯铁丝。弃去10%初馅!液和10%残留液。（4）无水乙醇不含有醛类物质检查方法：在盛有2mL银氨溶液的小试管中，加入3-5滴无水乙醇，摇匀，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中含有醛。脱醛方法：取2g硝酸银溶于少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入盛有IL乙醇的试剂瓶中，振摇后，暗处放置两天（不时摇动，促进反应）。取上清液蒸储，弃去初储液50M1。若乙醇中含醛较多，可适当增加硝酸银用量。（5）三氯甲烷应不含分解物，否则会破坏维生素A检查方法：三氯甲烷不稳定，放置后易受空气中氧的作用生成氯化氢和光气。检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水振摇，使氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银溶液，如有白色沉淀即说明三氯甲烷中有分解产物。光气是“光成气"的简称。由英文PhOSgCn（PhOS光+gen产生）翻译而来。光气最初是由氯仿受光照分解产生，故有此名。光气从化学结构上看是碳酸的二酰氯衍生物，是非常活泼的亲电试剂。容易水解。工业上用一氧化碳和氯气在高温下经活性炭催化合成。实验室可以由发烟硫酸和四氯化碳作用制备光气是窒息性毒剂的一种，学名二氯化碳酰，又称碳酰氯，是一种毒性很强的气体。常温下为无色气体，有烂干草或烂苹果气味，但浓度较高时气味辛辣。光气的沸点为7.6,凝固点-128,易挥发，稍溶于水，易溶于有机溶剂。研究证明：当生产环境中光气的浓度在每立方米3050毫克时，可引发人群急性中毒；在每立方米100300亳克时，人接触1530分钟，即可引起严重中毒，甚至死亡。光气易水解，产物无毒。在工业上主要用于塑料、制革、制药等。据专家介绍，光气遇水会分解成为一氧化碳和盐酸。因为人的肺部湿润，吸入光气后相当于遇水分解。一氧化碳能使人窒息，而盐酸会腐蚀人的肺部。因此，光气中毒主要是伤害呼吸器官。人吸入光气后，一般有224小时的潜伏期。吸入量越多，则潜伏期越短，病情越严重。人吸入浓度较低的光气时，局部刺激症状可不明显，但经过一段潜伏期后，则可直接损害毛细血管内膜，出现肺水肿。当吸入较高浓度光气时，中毒者可发生支气管痉挛，有些中毒者可在肺水肿出现之前即出现窒息症状。处理方法:试剂应先测验是否含有分解产物，如有，则应于分液漏斗中加水洗数次，加无水硫酸钠或氯化钙使之脱水，然后蒸馀。（6） 25%三氯化锌-三氯甲烷溶液用三氯甲烷配制25%三氯化锌溶液，储于棕色瓶中（注意避免吸收水分）（7） 50%氢氧化钾溶液（KoH）W/V（8）维生素A标准液视黄醇（纯度85%Sigma）用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为ImI相当于Img视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。（9）酚儆指示剂用95%乙醇配制1%溶液3、测定方法（1）试样处理根据试样性质，可采用皂化法或研磨法。1）皂化法适用于维生素A含量不高的试样，可减少脂溶性物质的干扰，但全部试验过程费时，且易导致维生素A损失。a、皂化:根据试样中维生素A含量的不同，准确称取。.5g-5g试样于三角瓶中，加入10InL氢氧化钾（1+1）及20mL-40mL乙醇，于电热板上回流30min至皂化完全为止。b、提取:将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，以30mL水洗皂化瓶，洗液并人分液漏斗如有渣子，可用脱脂棉漏斗滤人分液漏斗内用50mL乙醛分二次洗皂化瓶，洗液并人分液漏斗中振摇并注意放气，静置分层后，水层放人第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约30mL乙酸分二次冲洗，洗液倾人第二个分液漏斗中振摇后，静置分层，水层放人三角瓶中，酸层与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素A为止。c、洗涤:用约30mL水加人第一个分液漏斗中，轻轻振摇，静置片刻后放去水层。加15mL-2OmLO.5mol/L氢氧化钾溶液于分液漏斗中，轻轻振摇后，弃去下层碱液，除去酸溶性酸皂。继续用水洗涤，每次用水约30mL,直至洗涤液与酚Bfc指示剂呈无色为止（大约3次）。酸层液静置Iomin-2Onlin,小心放出析出的水。d、浓缩:将酸层液经过无水硫酸钠滤人三角瓶中，再用约25mL乙醛冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并人三角瓶内。置水浴上蒸馅I,回收乙醛。待瓶中剩约5mL乙醛时取下，用减压抽气法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内o2）研磨法适用于每克试样维生素A含量大于5ugT0Ug试样的测定，如肝的分析步骤简单，省时，结果准确。a、研磨:精确称2g-5g试样，放人盛有3倍5倍试样质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至试样中水分完全被吸收，并均质化。b、提取:小心地将全部均质化试样移人带盖的三角瓶内，准确加人50ml-100mL乙酸。紧压盖子，用力振摇2min,使试样中维生素A溶于乙醛中。使其自行澄清（大约需lh-2h）,或离心澄清（因乙醛易挥发，气温高时应在冷水浴中操作。装乙醛的试剂瓶也应事先放人冷水浴中）Oc、浓缩:取澄清的乙酸提取液2mL-5mL,放人比色管中，在7080水浴上抽气蒸干。立即加人1mL三氯甲烷溶解残渣。（2）测定1）标准曲线的制备准确取一定量的维生素A标准液于4-5个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量比色管顺次取InlL三氯甲烷和标准系列使用液1mL,各管加人乙酸好1滴，制成标准比色系列。于620run波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其标准比色列按顺序移人光路前，迅速加人9ml三氯化睇一三氯甲烷溶液。于6s内测定吸光度，以吸光度为纵坐标，维生素A含量为横坐标绘制标准曲线图。2）试样测定于一比色管中加人Ionl工三氯甲烷，加人1滴乙酸醉为空白液另一比色管中加人InIL三氯甲烷，其余比色管中分别加人InIl试样溶液及1滴乙酸酢。其余步骤同标准曲线的制备。4、注意：维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或使用棕色玻璃仪器。乙醛为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象。在提取、洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇破乳。所用氯仿中不应含有水分，因三氯化铺遇水会出现沉淀，干扰比色测定。故在每毫升氯仿中应加入乙酸酎1滴，以保证脱水。另外，由于三氯化睇遇水生成白色沉淀，因此用过的仪器要用稀盐酸浸泡后再清洗。由于三氯化睇与维生素A所产生的蓝色物质很不稳定，通常生成6S后便开始比色，因此要求反应在比色管中进行，产生蓝色后立即读取吸光度。如果样品中含B-胡萝卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮、乙烷混合液为洗脱剂进行柱层析。比色法除用三氯化锦做显色剂外，还可用三氟乙酸、三氯乙酸做显色剂。其中三氟乙酸没有遇水发生沉淀而使溶液混浊的缺点。三、B一胡萝卜素的测定(GBT5009.832003)第一方法是HPLC；第二方法为纸层析法。胡萝卜素是一种广泛存在于有色蔬菜和水果中的天然色素，有多种异构体和衍生物，总称为类胡萝卜素，其中在分子结构中含有B紫罗宁残基的类胡萝卜素，在人体内可转变为维生素A,故称为维生素A原。如Q、B、Y胡萝卜素，其中以B胡萝卜素效价最高。B一胡萝卜素的结构如下：胡萝卜素原只存在于植物性食品中，但以含有胡萝卜为食物的家禽、兽类、水产动物及其加工产品，以及为着色而添加胡萝卜素的食品，当然也含有胡萝卜素。胡萝卜素对热及酸、碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促进其氧化破坏。因系脂溶性维生素，故可用有机溶剂从食物中提取。胡萝卜素本身是一种色素，在450nm波长处有最大吸收，故只要能完全分离，便可定性和定量。但在植物体内，胡萝卜素经常与叶绿素、叶黄素等共存，在提取B一胡萝卜素时，这些色素也能被有机溶剂提取，因此在测定前，必须将胡萝卜素与其它色素分开。常用的方法有纸层析、柱层析和薄层层析法。原理：以丙酮和石油酸提取食物中的胡萝卜素及其他植物色素；以石油酸为展开剂进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离；剪下含胡萝卜素的区带，洗脱后于45Onnl波长下定量测定。四、维生素D的测定维生素D是指含有抗伺偻病活性的一类物质，具有维生素D活性的化合物约有10种，其中最重要的是维生素D2、维生素Da及其维生素D原。维生素D2无天然存在，维生素Dz只存在于某些动物性食物中。但它们都可由维生素D原（麦角固醇和7一脱氢胆固醇）经紫外线照射形成。维生素Dz药片吃多了中毒。分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法。（一）三氯化镇比色法原理：在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化睇结合生成一种橙黄色化合物，呈色强度与维生素D的含量成正比。样品处理：同维生素A的测定。食品中维生素D的含量一般很低，而维生素A、维生素E、胆固醇、速幽醇等成分的含量往往大都超过维生素D,严重干扰维生素D的测定，因此测定前必须经柱层析除去这些干扰成分。（二）液相色谱法它的的灵敏度较比色法高30倍以上，且操作简便，精度高，分析速度快。是目前分析维生素D的最好方法。1、原理试样在焦性没食子酸的保护下皂化，以石油酸萃取后，用正相色谱柱提取富集，用反相色谱柱进一步分离，紫外检测器定量测定。2、说明1、焦性没食子酸：抗氧化剂，试剂焦性没食子酸容易变性，应购习近期生产的试剂。单宁一一糅质，具有多元酚基和陵基的有机物质。包括：水解类（产生没食子酸）。缩合类（产生焦性没食子酸、焦儿茶酚）（1）没食子酸一一3,4,5三羟基苯甲酸（五倍子酸）（2）焦性没食子酸（苯三酚）有毒2、本法使用两级HPLa正相色谱柱用于维生素D的提取富集，反相型柱用于把维生素D与许多其他干扰物质分离。3、本法对维生素D2、维生素D3不加区分，两者混合存在时，以总维生素D定量。4、维生素D的含量表示可用mg100g,也可用国际单位（IU）,IIU相当于O.025ug维生素D。六、作业测定脂溶性维生素时样品需如何处理？七、课后记食品分析教案（第18次课2学时）一、授课题目第十章维生素的测定第三节水溶性维生素的测定二、教学目的和要求学习本章内容，要求学生了解水溶性维生素的测定方法，掌握VC的测定方法。三、教学重点和难点重点：VC的测定方法。难点：VC的测定方法四、主要参考资料1、穆华荣、于淑萍主编，食品分析.北京：化学工业出版社，20042、周光理主编，食品分析与检验技术，北京：化学工业出版社，20063、杨月欣主编，实用食物营养成分分心手册（第二版），北京：中国轻工业出版社，20074、曲祖乙、刘靖主编，食品分析与检验.北京：中国环境科学出版社，20065、http:/WWW6hts：WWW7http:/WWW五、教学过程1、学时分配：2学时2、辅导手段：自习答疑3、教学办法：讲授4、板书设计：（见上页）5、教学内容第三节水溶性维生素的测定一、概述水溶性维生素B1、B?和C,广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会从机体中排出。为避免耗尽，需要经常地由饮食来提供。1、水溶性维生素的理化性质（1）水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙酸、氯仿等大多数有机溶剂;（2）在酸性介质中很稳定,既使加热也不破坏；（3）但在碱性介质中不稳定，易于分解，持别在碱性条件下加热，可大部或全部破坏。（4）它们易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。2、前处理根据上述性质，测定水溶性维生素时，般都在酸性溶液中进行前处理。维生素Bl、B2提取盐酸水解活性人造浮石、 硅镁吸附剂淀粉降、木瓜蛋白陶纯化酶解维生素C通常采用草酸、草酸一醋酸、偏磷酸一醋酸溶液直接提取。在一定浓度的酸性介质中，可以消除某些还原性杂质对维生素C的破坏作用。草酸价廉，使用方便，对维生素C有很好的稳定作用偏磷酸本身不稳定，与水结合逐渐变成磷酸，只能保存7T0d,且价格较贵、溶解费时，但它能沉淀蛋白质，澄清提取液，适合于蛋白质含量高的样品。二、维生素氏的测定维生素BI又名硫胺素、抗神经炎素，通常以游离态，或以焦磷酸酯形式存在于自然界。在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色蔬菜和牛乳、蛋黄中含量较为丰富。分析方法：比色法（灵敏度低），荧光法，高效液相色谱法。GB/T5009.842003中唯一的方法是荧光计法（书中介绍）。（一）荧光比色法1、原理硫胺素在碱性铁鼠化钾溶液中被氧化成硫色素（毗哆色素），在紫外光照射下，硫色素发出蓝色荧光，在给定的条件下以及没有其他荧光物质干扰时，其荧光值与硫色素的含量成正比，即与溶液中硫胺素含量成正比。2、分析步骤（1）试样处理样品采集后将样品尽量处理均匀于低温冰箱中冷冻保存，用时将其解冻后使用。a、提取：加酸水解（硫胺素由结合态变为游离态），调PH为4.5（乙酸钠调节，溟甲酚绿为外指示剂），加淀粉酶（20mgg）保温过夜（45-50oC,16h）,冷却至室温，定容至100nlL,混匀过滤，即为提取液b、净化：盐基交换管（装好活性人造沸石：保持盐基交换管中液而始终高于活性人造沸石：防止浮石氧化，失去活性）。c、氧化：碱性铁氟化钾（加入量要充足，不能过量，否则将硫色素氧化）（2）测定3、说明（1）食品中的维生素Bl有游离型的，也有结合型的，即与蛋白质、淀粉等结合在一起，故需用酸和酶水解，使结合型成为游离型。（2）可在加入酸性氯化钾以后停止实验，因为硫胺素在此溶液中比较稳定。（3）样品与铁氟化钾溶液混合后，所呈现的黄色应至少保持15秒，否则应再滴加铁氟化钾溶液1-2滴。因为样品中如含有还原性物质，而铁氟化钾用量不够时，硫胺素氧化不完全，给结果带来误差。但过多的铁氟化钾会破坏硫色素，故其用量应恰当控制。（4）硫色素能溶于正丁醇（微溶于水），在正丁醇中比在水中稳定，故用正丁醇提取硫色素。萃取时振摇不宜过猛，以免乳化，不宜分层。（5）紫外线破坏硫色素，所以硫色素形成后要迅速测定，并力求避光操作。（6）用甘油-淀粉润滑剂代替凡士林涂盐基交换管下活塞，因凡士林具有荧光。（7）谷类物质不需酶分解，药品粉碎后直接用25%酸性氯化钾直接提取，氧化测定。（8）氧化是操作的关键步骤，操作中应保持加试剂的迅速一致。三、维生素B2的测定维生素氏即核黄素。在食品中以游离形式或磷酸酯等结合形式存在。膳食中的主要来源是各种动物性食品，其中以肝、肾、心、蛋、奶含量最多，其次是植物性食品的豆类和新鲜绿叶蔬菜。（一）理化性质：1、能溶于水，水溶液呈现强的黄绿色荧光2、对空气、热稳定3、在中性和酸性溶液中即使短时间高压加热也不至于破坏，在碱性溶液中则较易被破坏4、游离核黄素对光敏感，特别是紫外线，可产生不可逆分解。（二）分析方法：GB/T5009.852003中第一法为荧光法，第二法为微生物法。原理：维生素B2（即核黄素）在440-50Onm紫外光激发下产生黄绿色荧光，在一定浓度范围内其荧光强度与核黄素浓度成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光强度之差与内标荧光强度的比值，计算样品中核黄素的含量。注意：1、测定中，需用高锌酸钾氧化去杂质，用硅镁吸附剂吸附分离2、空白荧光值得测定测定方法及测定时应注意什么3、核黄素对光敏感，整个操作应在暗室中进行4、核黄素可被低亚硫酸钠还原成无荧光型，但摇动后很快就被空气氧化成有荧光物质，所以要立即测定。四、维生素B6的测定原理：卡尔斯伯（SaCCharOmyCeSCarlSbrgenSiS）酵母菌需在有维生素Bs存在的条件下才能生长，在一定条件下维生素B6的量与其生长呈正比关系。用比浊法测定该菌在样品液中生长的混浊度，与标准曲线相比较得出样品中维生素B6的含量。本方法检出限为o.lng。五、维生素C的测定维生素C是一种己糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以又称作抗坏血酸。维生素C广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、狒猴桃、柑桔等食品中含量尤丰富。维生素C具有较强的还原性，对光敏感,氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性。进一步水解则生成2,3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。测定维生素C常用的方法有：靛酚滴定法、苯脱比色法、荧光法和高效液相色谱法等2,6-二氯靛酚滴定法：测定还原型抗坏血酸，该法特异性差，2003年新制定的标准中已不用。2,4二硝基苯脏比色法和荧光法：测定还原型抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总含量。高效液相色谱法：测定还原型抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总含量。（一）荧光法GB/T5009.862003第一法1、原理（二）2,4一二硝基苯脱比色法GB/T5009.862003蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量测定方法第二法1、原理先将样品中的还原型抗坏血酸用活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，加2,4二硝基苯脏生成红色豚，根据豚在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比进行比色测定。2、试剂提取VC用：20gL草酸，10g/L草酸氧化处理用：活性炭（经HCl处理无铁离子）控制氧化用：20gL硫胭、10gL硫版显色用：20gL2,4一二硝基苯胧溶液，硫酸lmg/mL抗坏血酸标准溶液3、主要仪器恒温箱或恒温水浴锅可见一紫外分光光度计组织捣碎机4、操作步骤样品中VC的提取和处理提取：干样：样品(l-4g)+适量10g/L草酸，磨成匀浆，用10g/L草酸定容至100nlL容量瓶。过滤，得提取液。鲜样：样品+等量的20g/L草酸，捣碎成匀浆，取104Og匀浆，用10g/L草酸定容至100mL容量瓶。过滤，得提取液。注意问题：不易过滤的样品，可离心沉淀后取上清液再过滤。氧化处理：取25mL提取液+2g活性炭，振摇Imin,过滤。要弃去初滤液。取1OmL氧化提取液+10mL20gL硫服，此20InL氧化稀释液为待测液。相当于把提取液稀释了2倍。呈色，测定吸光度取三支带塞试管，各加入4mL氧化稀释液，留一支空白，另两支各加1.0mL20gL2,4一二硝基苯肺溶液。37恒温3h。取出，空白管在室温下冷却，另两支放入冰水中冷却。空白管冷却至室温后加LOmL20gL2,4一二硝基苯脏溶液，15min后放入冰水中冷却。在冷却中，分别向每支试管滴加5ml(9÷1)硫酸，滴加完毕取出，在室温放置30min后，用ICm比色皿，以空白管调零，50Onm测吸光度。从标准曲线查出氧化稀释液的维生素C的浓度。制标准曲线取50mLhngmL抗坏血酸标准溶液,加2g活性炭，振摇Imin,过滤。要弃去初滤液。取IomL滤液，加5.0g硫胭，用10g/L草酸稀释至50OmL容量瓶中，得20ugmL的抗坏血酸使用液。分别取5、10、20、25、40、50、60mL20ugmL的抗坏血酸使用液,分别放入7个容量瓶中，用10g/L硫胭稀释定容，得标准比色系列为：1、2、4、5、8、10、12ugmL.按步骤呈色，并测定吸光度。以吸光度为纵坐标，以抗坏血酸标准比色系列为横坐标，绘标准曲线。5、计算：从标准曲线查出氧化稀释液的维生素C的浓度。Pug/mL计算从提取到氧化处理过程中稀释的倍数。f对于干样，f=2；对于鲜样，f=取浆量/2样品量X2按教材P209公式计算总抗坏血酸含量。mg100g六、作业测定水溶性维生素时，从样品中提取浓缩可采用哪些方法？七、课后记板书设计§10-1概述一、维生索的命名1.2.3.二、维生素的共同特点1、天然食物中2、调解代谢，量少3、体内不合成4、适量三、测定意义1、2、3、4、5、四、分类五、理化性质六、测定方法第十章维生素的测定§10-2脂溶性维生素的测定一、概述1、理化性质2、原料处理方法二、维生素A的测定1、高效液相色谱法2、比色法(1)原理(2)试剂(3)测定方法三、B一胡萝卜素的测定四、维生素D的测定多媒体屏幕板书设计§10-3水溶性维生素的测定一、概述理化性质前处理二、维生素Bl的测定1、荧光比色法(1)原理(2)测定步骤：试样处理测定(3)说明第十章维生素的测定三、维生素B2的测定1、理化性质2、分析方法四、维生素Be的测定五、维生素C的测定1、荧光法2、比色法多媒体屏幕