过表达ABAD对Aβ1-42刺激的293T细胞线粒体功能和自噬水平的影响.docx

过表达ABAD对AB2刺激的293T细胞线粒体功能和自噬水平的影响洪婷婷张宇崔理立"()广东医科大学广东省衰老相关心脑疾病重点实验室广东湛江524001【摘要】目的探讨Api/刺激下，在293T细胞中过表达ABAD对线粒体功能的影响及自噬相关标记蛋白水平的变化。方法293T细胞分别经APM2(5M10M20M)处理后，ATP试剂盒测定其细胞ATP含量；活性氧试剂盒测定其活性氧生成量。自噬诱导剂处理后，WeSternbIot观察线粒体自噬相关蛋白表达量的改变。通过标准曲线换算ATP细胞含量和活性氧生成量，用ImageJ对WeSternbIOt条带进行量化。结果对照组与293T过表达ABAD组ATP含量和活性氯生成量无明显差异(P均>0.05)；与不给药组相比,在给予Aj2(IOuM)刺激后，293T细胞过表达ABAD的ATP含量减少，差异具有统计学意义(P<0.05),但两组的活性氧生成量无明显差异(P>0.05)；与DMSO处理对照组相比，CCCP自噬诱导剂处理组在Apb42IOuM诱导后线粒体自噬相关蛋白P62降低、LC3B升高，差异均有统计学意义(PvO.O5)o结论过表达ABAD不影响293T细胞的线粒体功能，但在特定浓度A,42刺激下可影响线粒体ATP产生及促进线粒体自噬发生。【关键词】：ABAD,A,线粒体功能：线粒体自噬；【中图分类号】R74【文献标识码】AEffectsofoverexpressionofABADonmitochondrialfunctionandautophagyof293TcellsstimulatedbyA,42HONGTing-tingZHANGYuCUILI-li*Guangdongprovincialkeylaboratoryofagerelatedheartandbraindiseases,GuangdongMedicalUniversity'Zhanjiang524001,Guangdong,ChinaAbstractobjectivetoinvestigatetheeffectofoverexpressionofABADonmitochondrialfunctionandthelevelofautophagy-associatedmarkerproteinin293TcellsstimulatedbyA32Methods293TcellsweretreatedwithAp42(5uM,IOuM,20uM)respectively,andtheirATPcontentwasmeasuredbyATPkit,andtheproductionofreactiveoxygenspecies(Ros)wasmeasuredbyRosKit.Aftertreatedwithautophagyinducer,theexpressionofMitochondrialautophagy-relatedproteinswasobservedbyWesternblot.TheamountofATPcellsandreactiveOxygenSpecies(Ros)werecalculatedbystandardcurve,andtheWesternblotwasquantifiedbyImageJ.ResultstherewasnosignificantdifferenceinArPcontentandreactiveoxygenspeciesproductionbetweenthecontrolgroupand293Toverexpressionabacigroup(P>0.05);comparedwiththecontrolgroup,theATPcontentof293TcellsoverexpressionABADwasdecreasedafterAm2(IOuM)stimulation,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05),buttherewasnosignificantdifferenceintheproductionofreactiveoxygenspeciesbetweenthetwogroups(P>0.05);comparedwiththecontrolgrouptreatedwithDMSO,mitochondrialautophagyrelatedproteinP62decreasedandLC3BincreasedinthegrouptreatedwithCCCPautophagyinducerafterAB.42(IOuM)stimulation(P<0.05).ConclusionoverexpressionofABADdoesnotaffectthemitochondrialfunctionof293Tcells,butcanaffecttheproductionofmitochondrialATPandpromotethedevelopmentofmitophagyunderthestimulationofA陋KeywordsAbad,A,mitochondrialfunction;MitochondrialAutophagyABAD(淀粉样蛋白结合醇脱氢酶)，也称170-HSDl0,是一种线粒体蛋白质。已知ABAD有一个LD区域，可特异性与A0结合，A。与ABAD形成的复合物导致ABAD结构异常，进而阻止ABAD与NAD+的结合，ABAD不能发挥酶活性，线粒体膜通透性发生变化，进而导致线粒体窘迫和细胞毒性。此外，ABAD可调节线粒体基质中的亲环蛋白D(cypD),后者可调节线粒体通透性过渡孔的开放。同时，已知人线粒体RNaSeP是由三种蛋白质(MRPPl(线粒体核糖核酸酶P蛋白1),MRPP2(17P-HSDlO)和MRPP3(Mg2+依赖性核糖核酸内切酶)组成，ABAD是MRPPl蛋白稳定表达所必需的，ABAD的突变会引起RNaseP组分活性降低和RNA加工缺陷，导致线粒体功能紊乱W叫A。肽是由a、和y-分泌酶水解酶切淀粉样蛋白前体蛋白(APP)所产生的。正常情况下，绝大部分产生的是A40,少量是A42,但后者具有更强的疏水性、聚集性以及神经毒性。A仇K可随年龄依赖性快速生成并积聚，引起神经毒性。研究发现A可聚集在线粒体内，降低呼吸链复合物酶的活性，减少线粒体的耗氧量，增加活性氧的产生，最终导致线粒体肿胀及后续的细胞凋亡比叫线粒体作为机体细胞代谢的能量工厂，通过不断的分裂和融合以为适应生命活动的需要，受损或多余线粒体的清除是维护细胞内环境的关键，线粒体自噬作为选择性自噬的一种类型，是机体清除受损线粒体的重要形式之一。理论上，线粒体功能絮乱，包括膜电位下降、活性乳生成增多、ATP产量减少等，会诱导机体启动线粒体自噬，受损线粒体通过与溶酶体结合，清除受损的线粒体。但目前尚未有ABAD与线粒体自噬的相关报告。本篇文章研究了在APy刺激下过表达ABAD对293T细胞线粒体功能的影响，并探究其是否影响自噬相关蛋白的水平。1材料与方法1.1 材料293T细胞（上海中乔新舟生物公司），血清、胰酶、双抗（美国GibCo公司），DMEM/F-12培养基（美国HyClone公司），（美国GibC。公司），LipoFiter>BCA蛋白检测盒（美国ThermO公司），ABAD过表达质粒、ABAD干扰质粒（上海毅乐生物），增强型ATP检测试剂盒、活性氧检测试剂盒（碧云天生物技术），CCCP（MCE）,A1.42（上海强耀生物科技有限公司），DMSO（青岛生物科技），抗体：LC3B（Sigma）,P62、ABAD（Abcam）,P-actin（CST）,低温高速速离心机（德国Eppendorf公司），酶标仪、化学发光仪（美国Thermo公司），曝光机（美国AzureBiosystems公司）。1.2 方法1.2.1 细胞培养与分组293T细胞购买于上海中乔新舟生物公司，使用完全培养基（10%胎牛血清+1%的双抗+高糖培养基）在37、5%C2细胞培养箱传代培养。倒置显微镜下观察细胞，每隔23d传代1次，用含EDTA胰酶消化3min,加两倍体积培养基终止胰酶消化。传代3次后进行实验。分组为1、正常组、ABAD过表达组、正常给药组（Ap.425uMIOUM、20uM）、ABAD过表达给药组（A425uMIOuMs20uM）1.2.2 细胞转染严格按照汉恒LiPOFiter说明书转染。细胞传代3次后，按IxIO5/孔接种，细胞培养箱中培养24h,在细胞密度在60%左右进行转染。ABAD过表达和ABAD干扰转染终浓度为2ug孔。转染5-6h后，更换新的培养基继续培养。24h后，用配制的不同浓度APy2刺激细胞24h1）1.2.3 A阮42的配制AB2母液配制：取人源A2单体，用HFlP重悬，在通风橱中挥发后获得A。肽膜，以DMSO溶解肽膜，稀释至适当浓度后，37孵育48h后即得到AB寡聚体，孵育后的溶液1周内使用。1.2.4 CCCP的配制CeCP母液配制：离心试管，在无菌操作台中称取适量CCCP粉末，加入DMSO,使浓度为20mM,充分震荡混匀离心，即得到CCCP母液，1月内使用。1.2.5 ATP检测按照产品说明书操作，吸除培养液，10OUl裂解液/12孔板每孔，移液器反复吹打,充分裂解细胞。裂解后4C12000g离心5min,吸取的上清即为样品。按照每个样品/标准品需IoOUlATP检测工作液的比例配制适当量的ATP检测工作液。把待用试剂在冰浴上融解。取适量的ATP检测试剂，用ATP检测试剂稀释液稀释ATP检测试剂(1:4)。稀释后的ATP检测试剂即为ATP检测工作液。加IoOUlATP检测工作液到检测管内，室温放置5min。检测管内加上20Ul样品/标准品，迅速用枪混匀，间隔2s后，用化学发光仪测定RLU值。1.2.6 ROS检测按照产品说明书操作，用无血清培养液稀释DCFH-DA(GoOO),使终浓度为10微摩尔/升。用稀释好的DCFH-DA重悬细胞，细胞浓度控制在约一百万至二千万/ml,37细胞培养箱中孵育20min。隔5min上下颠倒混匀，待探针和细胞充分接触后，用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。使用流式细胞仪检测荧光的强弱。1.2.7WesternBlot移除培养液，用冰PBS小心洗一遍，按IoOUI裂解液/6孔板每孔的比例加入裂解液，置于摇床冰上，裂解15min,用细胞刮充分刮数下，收集蛋白至EP管。检测细胞浓度(BCA蛋白检测法)。各组样本取相同摩尔质量和体积的蛋白量进行SDS-PAGE电泳(初始电压为60V,待蛋白条带入分离胶，调整电压至IoOV),预先将PDVF膜泡在甲醇液中5-1Omin,待电泳结束，将其转印至PVDF膜，赶走膜和胶之间的气泡，放入转膜槽(100mA,10Omin),IXTBST稀释的5%脱脂牛奶，摇床上常温封闭lh。将一抗和膜置于孵育袋中共同孵育，(一抗稀释液配制所有的一抗，浓度为1:1000),4度摇床过夜。回收一抗，1XTBST洗膜三次，IOmin/次。二抗用IXTBST稀释的5%脱脂牛奶溶解，与膜在摇床上常温孵育lh。IxTBST洗膜三次，1Omin/次。显色及曝光。将归一化后目标蛋白灰度值与内参-actin灰度值之间比值视为目标蛋白相对表达量。1.2.8 统计方法所有实验重复至少3次。用GraPhPadPriSm6.0对实验结果进行统计分析。表中数值均为平均值±标准误差(-÷s)o数据采用单因素方差分析(ANOVA)或者t检验进行分析。P<0.05表示差异有统计学意义。2结果1、在293T细胞过表达ABAD对线粒体功能的影响为确定在293T细胞中过表达ABAD对线粒体功能的影响，我们分别测试ATP、活性氧变化。如表1所示，ABAD过表达组与对照组相比，ATP的产量和活性氧的生成均无明显差异(P>0.05)°以上结果表明ABAD过表达不影响293T细胞线粒体功能。为进一步证实ABAD作为线粒体蛋白，在线粒体功能起重要作用，我们分别测试干扰ABAD后293T细胞的ATP和活性氧变化。如表2所示，干扰ABAD使293T细胞ATP产生减少(P<0.05),但不影响活性氧的生成(P>0.05)。表1：293T细胞过表达ABAD线粒1本功能的比较(x÷s,n=4)组别ATPROSControl0.9833±0.047130.6682±0.06820ABAD1.021±0.077440.7397±0.02966F值2.7005.288P值P>0.05P>0.05表2：293T细胞干扰ABAD线粒体功能的比较(X±s,n=4)组别ATPROSControlsh-ABAD19.43±0.907712.84±1.9710.8629±0.052880.8217±0.02315F值4.7175.217P值P<0.05P>0.052、在不同AP浓度刺激下，293T细胞过表达ABAD对线粒体功能的影响为了进一步验证AP刺激下，过表达ABAD对线粒体功能的影响，我们在293T细胞过表达ABAD后，加入5uMA阮42,分别测试其ATP和活性氧。如表3所示，无论有无Ap刺激,过表达ABAD均不能影响293T细胞ATP产量和ROS产生，这可能是AP浓度还不足以与ABAD结合，引起其构象改变，因此我们又增添了两个浓度的APm2(IOuMs20UM)。如表3所示，只有在APm2刺激浓度在IOUM时，过表达ABAD与对照组相比，ATP产量相对减少(P<0.05)o这可能是ABAD与ApiK的结合需要一定的浓度范围，浓度范围过低不能竞争结合ABAD,浓度过高，Ap<2本身的毒性作用已经足以损害细胞产能。表3：不同AB浓度下，各组的线粒体功能的比较(x±s,n=4)组别ATPROSControl1.028±0.045630.9032±0.04102ABAD1.072±0.0073400.8346±0.04814F值38.651.377P值P>0.05P>0.05Control+A(5uM)0.8559±0.037650.8346±0.03486ABAD+A(SuM)0.8918±0.034900.8656±0.02309F值1.1642.279P值P>0.05P>0.05Control+A(IOuM)0.9310±0.047470.7729±0.05607ABAD+A(IOuM)0.6607±0.086390.8437±0.1290F值2.4845.294P值P<0.05P>0.05Control+A(20uM)ABAD+A(20uM)0.8603±0.015100.8026±0.090600.8969±0.014950.8799±0.05456F值36.0013.32P值P>0.05P>0.053、在293T细胞过表达ABAD对线粒体自噬蛋白水平的影响过表达ABAD对线粒体功能无明显影响，且只在A。4特定浓度下，线粒体ATP产生减少。为进一步探究过表达ABAD与线粒体自噬的关系，我们在293T细胞中过表达ABAD24h,再用线粒体自噬诱导剂CCCP20uM处理6小时，观察线粒体自噬相关蛋白P62和LC3B的蛋白水平。如图1、表4所示，在293T细胞中过表达ABAD,P62蛋白水平下降(P<0.05),但不影响LC3B蛋白水平，提示正常ABAD过表达可能影响溶酶体，因为P62是溶酶体的标志蛋白。ControlControlABADABADLC3BP62ABAD-actinDMSOCCCP+-+-÷-+图1在CCCP自噬诱导剂诱导下，293T细胞过表达ABAD不引起线粒体自噬发生。表4：293T细胞过表达ABAD线粒体自噬相关蛋白P62和LC3B的比较(x±s,n=6)组别ABAD蛋白P62LC3BControl+DMSO1.284±0.14111.405±0.15611.872±0.2616ABAD+DMSO4.795±0.43981.028±0.044591.812±0.04539F值9.71612.2533P值P<0.05P<0.05P>0.05Control+CCCP1.070±0.16831.289±0.14522.550±0.2500ABAD+CCCP4.129±0.36620.8007±0.068202.768±0.1943F值4.7344.5361.655P值P<0.05P<0.05P>0.054、在A032刺激下，293T细胞过表达ABAD对线粒体自噬蛋白水平的影响只在Amy210uM诱导下，过表达ABAD可使线粒体ATP的产生减少，因此考虑ATP产生受损是否会诱发线粒体自噬，故我们在293T细胞中过表达ABAD,加入A-4210uM24小时，再加入CeCP诱导剂20UM6小时，观察线粒体自噬蛋白水平的变化，如图2、表5所示，在A/刺激下，CeCP诱导自噬过程中，293T细胞过表达ABAD使P62蛋白水平降低、LC3B水平升高（PV0.05）,提示过表达ABAD在Az2刺激下促进线粒体自噬发生。ABAD-actinDMSOCCCP图2在ABi2IOW刺激下，293T细胞过表达ABAD促进线粒体自噬发生表5：ABi210UM刺激下，293T细胞过表达ABAD线粒体自噬相关蛋白P62和LC3B的比较(x+s,n=6)组别ABAD蛋白P62LC3BControl+DMSOABAD+DMSO2.618±1.17133.61±0.99490.6984±0.043080.5764±0.034290.4990±0.050320.2407±0.01333F值1.3851.57814.25P值P<0.05P>0.05P<0.05Control+CCCPABAD+CCCP1.524±0.380841.52±1.6760.7621±0.052150.6184±0.021060.7583±0.033440.9289±0.03241F值19.366.1291.065P值P<0.05P<0.05P<0.053讨论ABAD属于羟基雷体脱氢能家族，在成人和胎儿的大脑海马和杏仁核的神经元细胞中表达最为丰富。在小鼠和爪蟾胚胎的研究显示，胚胎早期丧失ABAD可能是致命的，因为在小鼠胚胎中敲除ABAD基因，小鼠胚胎早期出现因线粒体功能隙碍引起的细胞凋亡和死亡，这意味着其在细胞存活中起着重要作用，且研究还发现这种作用独立于其醐的催化活性，可能只是它的存在，提供了某些结构功能或者维持结构的完整性。研究发现，ABAD的LD区域可特异性与AB结合，导致ABAD结构异常，不能发挥能活性，线粒体膜通透性发生变化，进而导致线粒体窘迫和细胞毒性。同时，也有报道表明，使用ABAD诱骗肽(ABAD-DP)来拮抗A和ABAD的结合能保护神经元线粒体功能，而ABAD与A分离,则能使线粒体、神经元免受AP的毒性阳2】。线粒体自噬是各种内外刺激诱发、由自噬囊泡包裹并吞噬受损的线粒体或需要降解的蛋白质，通过与溶酶体相结合，形成自噬溶酶体，降解其包裹的内容物的过程。当线粒体受损程度超出线粒体融合所不能中和的范围，机体将促线粒体进行分裂，通过线粒体自噬途径将受损线粒体清除，其中LC3B和P62是检测自噬通量的两个主要标志物。自噬发生时，新生成的LC3则从胞浆型LC3转变为膜型LC3；P62作为特异性底物，与LC3相互作用，在自噬-溶酶体通路中被降解，通过测量LC3比值和P62水平可评估自噬水平的高低。但当线粒体轻微应激时，则可能通过融合方法，将轻度受损的线粒体成分与健康的线粒体成分结合，以中和损伤的影响WL本研究发现，在293T细胞中，过表达ABAD并不会影响线粒体功能，而干扰ABAD则只能影响线粒体ATP的生成。仅在IOUM浓度A.42刺激下影响线粒体ATP的生成，并促线粒体自噬发生。综上，考虑出现这些情况的原因可能有以下几点：1、神经元是富需能场所，更易受A0聚集的破坏。Ap32对293T细胞产生的毒性作用亚于神经元细胞;2、ABAD作为线粒体成分，但其含量较小，其与A的结合仅些微改变线粒体功能；3、考虑到线粒体功能受损影响功能可能存在次序，而非同步出现，轻微的损伤只影响ATP的生成，而活性氧产生可能是后期受损严重的结果；4、线粒体严重受损才能诱发线粒体自噬，CCCP诱导剂本身也是具备毒性作用，加上ABAD与A的相互作用产生的毒性作用，才足以破坏线粒体，促使线粒体自噬发生。综上所述，过表达ABAD不影响293T细胞的线粒体功能，在特定浓度A042刺激下促进线粒体自噬发生。本次研究尚有很多不足之处，如线粒体功能及线粒体自噬检测方式多样，细胞器的选择及补充等，相关的实验还需进一步探究以明确ABAD与A的结合影响线粒体功能及自噬这一机制。参考文献1VinklarovaL,SchmidtM,BenekO,etal.Friendorenemy?Reviewof17beta-HSD10anditsroleinhumanhealthordiseaseJ.JNeurochem,2020.2张万飞，叶建新人类17p-羟基类固醇脱氧酶的功能J.海南医学,2008(01):127-130.3苏文，许华敏，康继宏，等.17-羟基类固醇脱氧酶的功能J生理科学进展，2014,45(01):27-31.4 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