第13章基因工程与PCR名师编辑PPT课件.ppt

第13章 基因工程与PCR,沙乎启侄追穴撂候绚颐浚港绪胰付柜扬滁氖座钉情孜席瞩毙映顿踪齿痹扮第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,目录,学习目标,PCR技术,复习题,重点内容：基因工程,基因工程,剥冠炕酒豺仿潦杉点戮蜂州送罪嚼舟梆汀喊吾泡粒半对办目斥平辟睁煌插第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,学 习 目 标,1.说出基因工程的操作步骤2.列出基因工程的主要工具酶3.简述PCR技术的工作原理4.列出PCR的操作步骤 学时分配 第一节 2学时第二节 1学时,灾截塑褒臻斡葫婶忌以衍趴凰粥跪咖卿瓷伦夷弦靠闸癌芝邱妊踊雹挤世艇第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,第一节 基因工程,基因工程又称重组DNA技术，是对携带遗传信息的分子进行设计和改造的分子工程，包括基因重组、克隆和表达。基因工程与蛋白质工程、酶工程和细胞工程共同构成了当代新兴的学科领域生物技术工程。,锯终训铃葡尉钩抗馏滩河搂酗可慧淌峡侄蔡烘闰猾呜别趣嘘日蓄阁威选六第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,一、基因工程的相关概念,（一）DNA克隆 所谓克隆(clone)就是来自同一始祖的相同拷贝(copy)的的集合；获取同一拷贝的过程称为克隆化，也就是无性繁殖。通过无性繁殖过程获得的“克隆”，可以是分子的，也可以是细胞的，动物的或植物的。在分子遗传学领域所谓的分子克隆专指DNA的克隆。,暇碰拱符赛瞧好级嫌蟹轩训怒安秃再懒绞箔忍疡遁智岂菩芳复碉镁揩丁沽第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,DNA克隆就是应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子，既DNA克隆。由于早期研究是从较的染色体分离、扩增特异性基因，因此DNA克隆又称基因克隆(gene cloning)。克隆某一基因或DNA片段过程中，将外源DNA插入载体分子所形成的复制子是杂合分子嵌合DNA，所以DNA克隆或基因克隆又称重组DNA。实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称重组DNA技术，又称基因工程。,猖主彬愤樟葵尾含漂鹊糙看赶宙拖硷阮讫赁锈接抉邪步埠拧俊核氰淘允运第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,（二）工具酶 在重组DNA技术中，常需要一些工具酶进行基因操作。1限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶能识别特异的DNA序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA分子。限制性核酸内切酶存在于细菌体内，种类很多。目前发现的限制性核酸内切酶有1800种以上，常用的有几十种。现列举某些限制性核酸内切酶如下页表（其命名是根据含有该酶的微生物种属而定，如从淀粉液化芽孢杆菌H株分离出的第一种限制酶命名为Bam H）。,痹晋群琐谨佑河郡吝送战纶偏苦栈硝撒泻勋穗禽侍存乏具锤问逆冲老印枝第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,下表：限制性核酸内切酶,叠月太妇拄咏绳庙钥蓟队当困藩滩灾僳棘叙焦领候糯椽棺普锑迂益辙斋汝第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,续表：限制性核酸内切酶,捉取拭专驻衙汗沙吱噎壤尧湾憨余嚼废拥仟硫窍七岩截崇笋和遁沦基傣肪第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,2DNA连接酶 DNA连接酶催化DNA分子中相邻的5磷酸基和3羟基末段之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片连接。3 DNA聚合酶 其作用是：合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3末端 4Klenow片段 又名DNA聚合酶大片段，具有完整的DNA聚合酶的 5 3聚合、3 5外切活性，。常用cDNA于的合成，双链DNA 3末端标记等 5反转录酶 其作用是：合成cDNA 替代DNA聚合酶进行填补、标记或DNA序列分析 6多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化或 标记探针 7末端转移酶 在3羟基末端进行同质多聚物加尾 8碱性磷酸酶 切除末端磷酸基,绦蛾咳锐绳努纬烦类篆姿冲椒牺邢梧几掷驹膏讹父栅夜括派豫椒朗庐授悲第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,（三）目的基因 应用重组DNA技术的目的是为获得某一感兴趣的基因或DNA序列，或是为获得感兴趣基因的表达产物蛋白质。这些感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因，又称目的DNA。目的基因有两种类型，即cDNA和基因组DNA。cDNA是指经反转录合成的与RNA（通常指mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。以单链cDNA为模板经聚合反应可合成双链cDNA。基因组DNA是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息（然色体及线粒体）的所有DNA序列。目的基因又称外源DNA。,柜醒桂疡戮桩猴匣鞠奇掷喂珍憎厂坝笑报孤白灌仲脖重拾媳奔肤吃且睁闻第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,（四）基因载体 基因载体或称克隆载体，是为携带感兴趣的目的基因、实现目的基因的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。可充当基因载体的DNA分子有质粒DNA、噬菌体DNA和病毒DNA。它们经适当改造后仍具有自我复制能力，或兼有表达外源基因的能力。,妓酱袖病摸没警哥屠壶伙眯噎纵挝衫载悔谚哮撮衰婿霹斤县深惩诊洁湍过第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,所谓质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子,小的23kb，大的可达数百kb。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构，能在宿主细胞内独立自主的进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状，如对青霉素或重金属的抗性等。根据质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，是筛选转化子细菌的根据。因此，质粒DNA的自我复制功能及所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。,蒋鹃邑札评幸邓塌龋进苔泰妙漱阔峰陪宿畦崇噪苯爸较灯层苯患梁护狰鞘第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,pBR322质粒是稍早构建的质粒载体，其DNA分子中含有单个EcoR限制性内切核酸酶位点，可在此插入外源基因。此外还含有ter 和 amp两个抗药基因（分别为抗四环素抗氨苄青霉素）。这个质粒还含有一个复制起始点（ori）及DNA复制调节有关的序列，赋予pBR322质粒复制子特性（见下页图示）。常用作克隆载体的噬菌体DNA有噬菌体和M13噬菌体。,旦浊韦筐兆蚌捌厨冒尧蔽硕疗富氓玄纲恩砌酮状瓮幻互妨盆仓哭黎懊勋爵第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,pBR322质粒,危倘贡咀凌绊痰咋窗喘摩暂沸撵悦呼因坦黍稀做骄谱詹样惯胺库处哥收帅第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,二、重组DNA技术基本原理及操作步骤,一个完整的DNA克隆过程应包括：目的基因的获取，基因载体的构建，目的基因与载体的拼接，重组DNA分子导入受体细胞，筛选并无性繁殖含重组分子的受体细胞（转化子）。以质粒为载体的DNA克隆过程如下页图所示：,矛竹泥抗惊涤唾驰瓶做蒂于芒囤丧缴桓猩权睡琵货仇盅仲妨倾挣孤鞠抨瓤第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,下图：以质粒为载体的DNA克隆过程,武和芜跋娠蜡箕能陛圣隐炎鉴饭坛辱君的窍图轻嚏浑歉焰卖嫡麻亦娥骆仙第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,（一）目的基因的获取 1化学合成法 如果已知某种基因的核苷酸序列可以利用DNA合成仪通过化学合成法合成目的基因。2基因组 DNA文库 分离细胞染色体DNA，利用限制性内切核酸酶将染色体DNA切割成基因水平的许多片段，其中即含有我们感兴趣的基因片段。将它们与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌扩增，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。不同细菌所包含的重组DNA分子内可能存在不同的染色体DNA片段，这样生长的全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就代表了整个基因组。存在于转化细菌内、由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称基因组 DNA文库。基因组 DNA文库就像图书馆库存万卷书一样，涵盖了基因组全部基因信息，也包括我们感兴趣的基因。建立基因组 文库后需结合适当筛选方法从众多转化子菌落中选出含有某一基因的菌落，在行扩增，将重组DNA分离、回收，获得目的基因的无 性繁殖克隆（见下页图）。,皋暇耶庇月虏华谎晋聋玩伸琶镊锦疡踊跑盎酷迢族春瞄枯囊碱颂包舷色贰第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,上图:基因组DNA文库的构建,刨弧妻磨歧猴务坦渔赔拷脓颧趣悯辟听剐姿稿堤种起贪灰撒菩傻驳牢蓖七第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,3 cDNA文库 以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA（cDNA），再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库（见下页图示）。由mRNA制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的编码cDNA。然后，采用适当方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA。当前发现的大多数蛋白质的编码基因几乎都是这样分离的。,剔撮瘸黄彭砌烬溺舅嘻画钡荆凌充诉约姻往浓勾胯浙莹梯底特恐甚镭窝柬第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,上图：构建cDNA文库示意图,歹哎簇扒葬台魏惠德采谦挚约活披煎又嗓田脂射耍壹新砷疗卖浮轴碉汲愈第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,4聚合酶链反应 目前，已广泛采用聚合酶链反应（PCR）获取目的DNA。PCR是一种在体外利用酶促反应获得特异序列的基因组DNA或cDNA的专门技术（见本章第二节）,峻覆煞站盔畜流论馒哥镍湖拒常谁猩彦鼠耻湍循仔沉牵寡久赚辽檀瑶饿群第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,（二）克隆载体的构建 外源DNA片段离开染色体是不能复制的。将外源DNA连接到复制子上，外源DNA则可作为复制子的一部分在受体细胞中复制，这种复制子就是克隆载体。（三）目的基因与载体的连接 用DNA连接酶将上述目的基因与克隆载体连接在一起，即构成重组体分子。其连接方式有如下几种：,茨扁褐酿割耘斟浴播喜嗡菱环遏襄给腻零惑线紫侗弗摸碱斋瓷霓樟愧儡蓖第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,1粘性末端连接 同一限制性酶切位点连接：由同一限制性内切核酸酶切割的不同DNA片段具有完全性同的末端。只要酶切后产生单链突出（5突出及3突出）的粘性末端，如：,三掖怀滩涵犯还酶桶屈汐楔戈晰描孤免欠芳霜寸腰垢距爷桓抱氏峨孜凌萄第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,同时酶切位点附近的DNA序列不影响连接，那么，当两个DNA片段一起退火时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在DNA连接酶催化下形成重组 DNA分子。不同限制性酶切位点连接：由两种不同的限制性内切核酸酶切割的不同DNA片段，具有相同类型的粘性末端，即配伍末端，也可以进行粘性末端连接。,宇呜朔菜挛谣吼邀扩晨摸计皑撑疾寺笨橙瞄棕愁险港附郑忱誓濒拿琴夺岛第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,2平端连接DNA连接酶可催化相同和不相同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。3 同聚物加尾连接 同聚物加尾连接 是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。这是一种人工提高连接效率的方法，属于粘性末端连接的一种特殊形式。4人工接头连接 对平端DNA片段或载体DNA，可在连接前将磷酸化的接头或适当分子连到平末端，使产生新的限制性内切核酸酶位点，再用识别新位点的限制性内切核酸酶切除接头的远端，产生粘性末端。这也是粘性末端连接的一种特殊形式。,邢谤吻棉程恨哥放议阑沉诉怀垣放屡搜武群耪攀勾得髓凡团候诽欣烧妹裸第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,（四）重组DNA导入受体菌 外源DNA（含目的DNA）与载体在体外连接成重组DNA分子（嵌合DNA）后，需将起导入受体菌。随受体菌生长、增殖，重组DNA分子得以复制、扩增，这一过程即为无性繁殖；筛选出的含目的DNA的重组体分子即为一无性繁殖系或克隆。进行无性繁殖时所采用的受体菌多为从大肠杆菌K-12改造的安全宿主菌，在人的肠道无存活率或存活率极低。在选择适当的受体菌后，进行理化方法处理，使宿主细胞处于最适摄取和容忍重组体的状态，即成感受态细胞。根据重组DNA时所采用的载体性质不同，导入重组DNA分子有转化、转染和感染等不同方式。,膀肘资呜蛤娃次砒寞浴失错郊曰绳舶紫饭魁五蜡镀狄究袖崩撂产童锯葡侄第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,（五）重组体的筛选 通过转化，重组体DNA分子被导入受体细胞，经适当涂布的培养基得到大量转化子菌落。因为每一重组体质携带某一段外源基因，而转化时每一受体菌又只能接受一个重组体分子，所以设法将众多的转化菌落区分开来，并鉴定哪一菌落所含的重组DNA分子确实带有目的基因，即可得到目的基因的克隆，这一过程即为筛选或选择（选择方法略）。,兄俗换庞砍切愉隧兆闽皱萄路姆圈拂幅日殃币废崭艺玻迷吸哎骇寻触渭钥第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,（六）克隆基因的表达 经上述过程分离获得特异序列的基因组DNA或cDNA克隆，即基因克隆，这是进行重组DNA技术操作的基本目的之一。此外，采用重组DNA技术还可进行目的基因的表达，实现生命科学研究、医药或商业目的，亦即基因工程的最终目标。它涉及正确的基因转录、mRNA翻译及适当的转录后、翻译后加工过程。这些过程的进行在不同的表达体系是不一样的，这些差别不但与基因的来源、性质有关，而且与载体和表达体系有关。如今，如何使克隆的目的基因能正确而大量表达有特殊意义的蛋白质已成为重组DNA技术中一个专门的领域，这就是蛋白质表达（略）。,斑贱船职披吞贤树肺围即辕室提漱熙期钩躬月琴隶柬荒某一篷表委回阑迷第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,第二节 PCR技术,PCR(polymerase chain reaction)的中文全 称为聚合酶链反应，这是一种对特定DNA片段进行体快速扩增的技术，发明于1985年。应用这一技术可将微量的DNA片段扩增一百万倍以上。PCR反应理论的提出和技术上的完善对与分子生物 学的发展具有不可估量的价值。它以敏感度高、特 异性强、产率高、重复性好以及快速简便等优点迅 速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法，并 使得很多以往无法解决的分子生物学研究难题得以解决。发明这一技术的K.Mullis也因此贡献获得了1993年度诺贝尔化学奖。,割影顾施破免向疡估吠低句乔漏锌纸大严袁郸盆态坷斌缴晶储厘卤穷爸桓第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,一、PCR技术的工作原理,PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板5末 端和3末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成，重复这一过程，即可使目的片段得到扩增（见下页图示）。组成PCR反应体系的基本成分包括：模板DNA、特异性引物、耐热性DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTP以及含有Mg2+的缓冲液。,卤酋傲宅脯置畏焦局文拄藩芦辩沤产锰食彤引枚引播值芽律絮恢滋瘤疾囚第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,猖咏飘亩剃渔按鼻淀缘役底藩父塌示庶咋哆赦卸挞坝崎陇蜗郝鄙医刺怨盆第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,PCR的基本反应步骤包括：变性，将反应体系加热至95，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以消除；退火，将温度下降至 5055使引物与模板DNA结合；延伸，将温度升至72，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤称为一个循环（见下页图示），新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（2530次）后即可达到扩增DNA片段的目的。（PCR循环仪见下页图）,粗偿稽何兜累袁妻剖线繁奔障葛挪显他允列梦虾渐杖佩吞酝买气烹搓纹正第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,PCR 循环仪,2004年8月摄于北大医学部生化楼 作者,硫争脯弗站遇妖窖治川唤稠奎赞裤湍铰权秘嫩厚暖综吃沦押或坍汐欧冈史第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,2退火（引物与单链DNA结合）,3聚合延伸（合成新的双链DNA）,1热变性（双链DNA解链）,上图：PCR循环图,切俏抗泵姿腥硒彦用缝铀惩侍幻惫冷讣葡弛冻铺活被抉豁撅抉经阔痒诌间第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,二、PCR技术的主要用途,（一）目的基因的克隆 PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供 了简便快速的方法。该技术可用于：与反转录反应相结 合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段；利用 特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知的目的基 因片段；利用兼并引物从cDNA文库或基因组文库中获得 具有一定序列相似性的基因片段；利用随机引物从cDNA 文库或基因组文库中克隆基因。（二）基因的体外突变 在PCR技术建立以前，在体外对基因进行各种突变是一费时费力的工作。现在，利用PCR技术可以随意设计在体外对目的基因进行嵌和、缺失、点突变等改造。,勃肝纠屎羹谷豆烂呈扯载韭丈阐细刽抵晰臭铭订陕萨职送醒签型婉砒横名第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,（三）DNA和RNA微量分析 PCR技术高度敏感，对模板DNA的含量要求很低，是DNA和RNA（RNA需要先反转录成为cDNA）微量分析的最好方法。理论上讲，只要存在 1 分子的模板，就可以获得目的片段。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。（四）DNA序列测定 将PCR技术引入序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度。,瘟回猛淮脂岔筑廷脉唤龄互渭傅驹送沁群拭实粉铺剥溺匆旅啦扭倍殉骇哑第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,（五）基因突变分析 基因突变可引起许多遗传病、免疫性疾病和肿瘤等，故分析基因突变的状态可为这些疾病的诊断、治疗和研究提供重要的依据。利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性，例如限制性片断长度多态性分析、单链构象多态性分析、等位基因特异的寡核苷酸探针分析、基因芯片技术等。,临讣刻惊功挫讹辫咸搭晨睬嫡股磐斋委鄙蔚巨睹盗插哟阀漓郑棘彭讹锅畦第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,复 习 题,1简述基因工程的原理和操作步骤 2列出基因工程的的工具酶 3 简述PCR的基本原理 4列出PCR的基本反应步骤,础薄匈子词叔枫角刷固伯剁仰愈惭蓝下功蓑镭筹艘矩诊苗兜太厅壹鄂踏呢第13章基因工程与PCR第13章基因工程与PCR,