第13章基因工程和基因组学.ppt

1,第十三章基因工程和基因组学,2,1971,美国史密斯,细菌,限制酶;1972,伯格,限制酶分别酶切猿猴病毒DNA与噬菌体DNA,用DNA连接酶连接,新的DNA分子;1973,科恩将重组外源DNA片段与质粒连接起来,重组质粒,转入大肠杆菌;1974,异源真核生物基因在大肠杆菌中的表达;1982,基因工程方法在细菌中表达生产的人体胰岛素进入市场;1985,烟草花叶病毒的外壳蛋白基因导入烟草获得成功;1986,基因工程生物实验性地释放到环境中;19901992,头一个转基因小麦,玉米;1994,基因工程西红柿在美国上市;1996,克隆羊多利诞生.现在,利用基因工程技术创建新的生命形态,生产药品,疫苗,牛奶和食品,诊断和治疗遗传疾病.,3,第一节基因克隆所需要的酶,4,一、限制性内切核酸酶,1、限制性内切核酸酶的发现和限制性修饰现象,5,2、型限制性内切核酸酶EcoB：识别序列 T-G-A-（N）8-T-G-C-T；甲基化的位点 第3或第9腺嘌呤Ecozk：识别序列 A-A-C-（N）6-G-T-G-C；甲基化的位点 目前还不清楚特点：1kb左右距离进行随机切割，70个左右的核苷酸，基因工程中运用极为有限,6,3、型限制性内切核酸酶2300多种，可识别230多种不同的DNA序列，基因工程中运用十分广泛。特点：（1）：能够识别特异性的DNA识别位点，这种识别位点通常是具有双链回文对称的结构；（2）：切割后形成的双链DNA分子能够彼此互补并能够重新连接；（3）：切割和修饰功能由两种不同的酶催化所完成；（4）：切割不需要ATP和SAM作为活性催化因子。,7,例如：EcoR;Hind;BamH;Pst;Xho（黏性末端）Sma;Xma（平头末端）Sfi Mbo;Hph,3-GGG-5,3-CCC-5,5-CCC-3,5-GGG-3,3-GGGCCC-5,5-CCCGGG-3,Sma切割双链DNA产生5突出的平头末端,8,4、型限制性内切核酸酶与型极为相似，EcoP 1 EcoP 1 5，运用极为有限。特点：（1）：具有特异的识别位点，这种识别位点是非对称的；（2）：切割位位点通常位于识别位点的3一侧25个碱基处进行单链切割DNA分子；,9,5、其他限制性内切核酸酶目前还发现了一些识别特殊碱基序列的限制性内切核酸酶，如在大肠杆菌中发现识别羟甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和4-甲基胞嘧啶DNA分子的限制性内切酶,McrBC。,10,6、限制性内切核酸酶的命名和分类几条基本原则：（1）：利用属名的第一个字母和种名的前2个字母代表内切酶的来源。Escherichia coli,Eco;Haemophilus influenzae,Hin;（2）：内切酶的第4个字母表示酶来源的菌株和菌型。EcoRI中的R就表示该内切酶来自于大肠杆菌的R菌株,如果还不足以说明，有些情况下还加上数字1或2来表示例如EcoR1等。（3）：在同一种菌株中分离获得的不同内切酶按照分离时间的先后以罗马数字加以标注。来自流感嗜血菌的几种不同的限制性内切核酸酶就用Hind、Hind、Hind 等表示。,11,7、影响限制性内切核酸酶的一些因素和实际工作中采用的方案。限制性内切核酸酶试剂盒，都提供了酶切优化配方。（1）DNA的浓度和质量是影响酶切的最为关键的因素。（2）酶切消化的缓冲液。（3）酶切反应的温度。（4）其他因素。反应的时间、消化过程中能否保持恒定的体积（在混合物上覆盖一层矿物油来防止缓冲液中的水分散失）（5）部分消化和过消化。,12,8、限制性内切核酸酶在生物技术中的运用。限制性内切核酸酶在基因克隆中就象外科医生的手术刀。（1）构建重组的DNA分子。（2）探针的制备。（3）DNA物理图谱的构建。（4）DNA甲基化的分析,13,二、DNA聚合酶DNA聚合酶的重要特性是将脱氧核糖核酸连续地连接到双链DNA分子的3-OH末端，催化核苷酸的作用，形成长链的核酸分子。依据DNA聚合酶的作用和来源不同，可分为以下同种：（1）大肠杆菌DNA聚合酶、Klenow酶和T4 DNA聚合酶（2）Taq DNA聚合酶（3）RNA反转录酶（4）末端转移酶（5）DNA连接酶（6）碱性磷酸化酶（7）其他种类的核酸化酶类,14,第二节基因克隆所需要的载体,15,在基因工程实验中，载体作为一种运载工具通常用于装载外源的DNA片段或者基因，并将它转入受体细胞，使外源片段DNA分子能够在受体的细胞中进行繁殖，这种特殊的DNA分子称为基因克隆载体。,基因克隆载体必备的一些基本条件：（1）1个或多个克隆位点。（2）携带外源的DNA片段（基因）进入到宿主细胞中能够进行自我复制，或者外源的DNA片段能够整合染色体随着染色体的DNA复制而同步进行自我的复制。（3）载体必须具有可供选择的标记，如抗生素标记。（4）载体必须是安全的，不含有对受体细胞有害的基因，对于细胞的生长不会产生显著的影响。,16,一、基因工程载体种类,通常包括质粒载体、噬菌体载体（包括噬菌体和质粒为基础构建的Cosmid载体），人工染色体载体（YAC、BAC、PAC、TAC）等。,17,二、质粒载体：质粒是存在于宿主细胞染色体外的一种裸露的双链DNA分子（或者RNA分子），在宿主细胞体内通常以共价闭合环状的超螺旋形式存在。基因工程中通常使用5kb以下的质粒。商业化的质粒载体一般有如下的生物学特性：（1）质粒DNA的复制质粒是在宿主细胞中能够自我复制的遗传单元，它是存在于宿主染色体以外的非必要组成部分，它能够随着细胞的自我复制而分配到后代中去。（2）质粒DNA的不亲和性质粒往往不能在同一宿主细胞中共存。（3）质粒的DNA接合性性质粒往往具有促使宿主细胞与受体细胞相结合，从而使遗传物质从宿主细胞向受体细胞中转移。,18,2、质粒载体的构建用于基因克隆的质粒载体应具有操作方便、易于检测、插入后能够稳定不丢失的优点。,质粒构建的几个原则：（1）质粒载体具有能自我复制的元件，这也是所有克隆载体必需的。（2）质粒载体上具有允许外源基因插入的多克隆位点，实际上在实际运用的载体上具有的多克隆位点数为一个。（3）质粒载体上同时必须有可供筛选的抗生素标记：已经在质粒载体上使用的抗生素标记基因包括Ampr,Terr,Kanr等。（4）构建的质粒载体应该足够小：由于质粒载体在进行遗传转化时，转化的效率与载体的大小有关。,19,四、人工染色体载体,1、人工染色体载体的种类构建人工染色体必须满足几个基本的条件：必须具有行使正常染色体功能所必需的各种元件，主要是着丝粒、复制起点和端粒。着丝粒是在细胞进行有丝分裂中期与纺锤丝微管相结合的部分，牵动染色体有规律地分配到子细胞中的部分。端粒是保持染色体进行稳定性、染色体正常、精确地复制和维持染色体长度所必需的元件。复制起点是所有生物进行DNA复制所必需的。,20,2、酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）3、细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome,BAC）4、其他类型的人工染色体P1人工染色体（P1 artificial chromosome,PAC）植物可转基因人工染色体（transformation-competent artificial chromosome,TAC）,21,不同类型载体的克隆外源片段能力比较,22,第三节植物基因组文库的构建,23,基因库(library):是一组DNA和cDNA序列克隆的集合体植物基因组文库构建必须符合以下几个基本条件,（1）文库能够覆盖整个基因组（2）插入的片段比较大：如插入的片段太小，基因组文库要求的克隆数目太多，不利于染色体的步移和组装。（3）文库比较稳定，且容易保存和操作：外源的片段插入到载体以后片段本身不会丢失，并且片段之间不会发生重组现象。,24,植物基因组文库构建通常包括以下几个基本步骤,（1）大片段DNA克隆载体的准备（2）大分子质量的植物基因组DNA制备。（3）大片段DNA分子的部分酶切。（4）载体与外源片段的连接。（5）载体的遗传转化。（6）克隆的挑取和验证及植物基因组文库的保存。,25,第四节基因克隆的方法,26,模式植物：水稻、拟南芥、烟草,基因测序基因功能需要大量基因基因克隆基因克隆方法（几十种）：归纳为5大类以已知序列为基础的基因克隆方法、以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法、以人工突变体为基础的基因克隆方法、以表达差异为基础的,27,一、以已知序列为基础的基因克隆方法,1、以氨基酸序列为基础的基因克隆方法（最为经典）通过对表达的或者差异的蛋白质分子的序列进行测定分析以后，获得该蛋白质的一段氨基酸的序列。根据编码不同氨基酸的密码子设计出一条简并引物，利用这条RT-PCR或者进行RACE-PCR扩增的方法克隆基因的全长。2、RACE-PCR与同源序列法扩增全长基因RACE（rapid amplification of cDNA end）即快速扩增cDNA末端可分为以下几个步骤：A：mRNA反转录为一链的cDNAB：利用5 cDNA的帽子结构设计出的引物分别与基因的特殊引物进行PCR嵌套扩增得一条或者几条特异的PCR带型C：分别将这些带型克隆到质粒载体上进行PCR测序，通过分析和比较以后可以获得待克隆基因的3端的片段。,28,二、以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法,A：首先通过遗传分析将目的基因定位在染色体的一定区间内，或者说在目的基因的两侧获得若干个连锁的分子标记。B：基因组文库的构建C：进行染色体步移或者染色体登陆（基本思路是首先利用分子标记分离到与分子标记同源的插入克隆，然后通过重叠群的分析获得候选基因克隆的一种方法）。D：对候选基因片段的功能互补分析、序列测定和基因结构鉴定。,标记1,标记2,Ti-DNA,功能验证,图位基因克隆法的基本步骤和原理,功能验证,遗传转化,染色体步移（登陆）,基因定位,29,三、以人工突变体为基础的基因克隆方法,1、转座子标签法,含有转座子和报告基因的载体构建,遗传转化,突变体筛选,反向PCR或者TAIL-PCR获得侧翼序列,利用侧翼序列为探针分离基因,30,2、T-DNA标签法T-DNA是存在于植物根癌农杆菌Ti质粒中的一段特殊的DNA序列，当根癌农杆菌感染寄主植物细胞以后，T-DNA 分子在Vir基因的帮助下会从细菌细胞转移到植物细胞中，通过T-DNA 两端的25bp左右的碱基重复序列，随机地整合到植物基因组中。如果T-DNA整合到功能基因的内部或者功能基因的调控区域，这种整合就可能导致功能基因的失活产生各种不同的突变。T-DNA上具有20bp左右的特殊重复片段，可以利用该片段为引物通过反向PCR的方法扩增获得T-DNA插入区间的相连片段。再以该片段为探针对突变体的基因文库进行筛选就可以分离含有目的基因克隆。,31,四、以表达差异为基础的基因克隆方法,1、文库扣除杂交法（是开展差异表达基因克隆的最为经典的方法）,双链cDNA,cDNA文库,组织B,组织A,双链cDNA,cDNA文库,文库影印到杂交膜,组织A或者B的双链cDNA为探针,差异克隆/基因,文库扣除杂交法分离基因的示意图,32,2、mRNA差异显示反转录PCR3、抑制消减杂交法4、代表性的差异显示法,33,五、根据生物大分子之间的相互作用克隆基因的方法,1、酵母双杂交体系2、噬菌体展示技术,34,PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）的简称，已成为当前分子生物学研究的主要技术手段。它是模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行的特异DNA序列扩增。它可以在一只小离心管中，短短的几小时内使某特异DNA片段扩增数百万倍，所需的DNA模板量少，而且DNA粗提物质就可得到良好的扩增效果，因而这一技术为外源基因整合的检测提供了便利的条件，尤其是在转化材料少又需及早检测的时候。利用PCR扩增检测外源基因整合时，要以被检组织DNA为模板，以外源基因序列设计引物进行扩增，然后用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。若被检植株基因组DNA中含有外源基因，则可得到扩增产物，琼脂糖胶上就会出现特异性扩增的条带。非转化植株基因组DNA中不含有外源基因，则无特异性扩增带出现。通过特异性扩增条带的有无及其分子量的大小可对外源基因是否整合做初步判断。,一、PCR检测,35,1、PCR技术原理,PCR技术是模拟体内DNA复制合成过程，在体外进行的特异性扩增某DNA片段的方法。原理是利用DNA聚合酶能够以引物3-OH为起点，催化dNTP按模板顺序，合成模板互补链。根据这一原理，在体外进行目的片段扩增时，只需设计两个特异引物，由目的片段的双链DNA（即模板DNA）与设计的引物，四种dNTP的等量混合物、DNA聚合酶、缓冲液构成扩增系统，就可以快速扩增目的片段。,36,2、引物设计及合成,PCR引物，一般为1530个核苷酸，主要通过人工合成获得。高效而专一性强的引物是特异性扩增的关键。引物设计的基本原则是：（1）引物中的（G+C）含量在45%55%。（2）四种碱基应随机分布，避免单一碱基的连续排列。（3）防止引物内部形成二级结构。（4）两个引物之间不应发生互补，尤其在引物的3端要避免“引物二聚体”形成。（5）3端末位碱基尽量不要选用A。扩增外源基因的引物设计在不严重违反上述原则时，最简单而有效的方法是，以该目的基因5端的20个碱基序列做5端引物，以该基因3端20个碱基顺序的互补序列做3端引物，扩增的产物即该基因。一般情况下，在设计外源整合基因的检测引物时，应该利用计算机程序设计。,37,3、模板DNA制备,PCR对模板DNA的质量要求不高，有时可以简单到直接利用细胞裂解液。但由于细胞裂解液中DNA成分复杂，目的序列浓度相对又很低，而且产生错误的机会增多，所以对于外源基因整合的检测，通常带要求制备出植物基因组DNA或总DNA：植物基因组的制备方法可以采用快速微量法，常用的有CTAB（二六烷基溴化铵）微量提取法和SDS微量提取法。检测时要有阴性对照及阳性对照，所以需分别从转化植株及非转化植株中以同样的方法提取基因组DNA。,38,4、反应体系,PCR反应体系中包括以下成分：Taq DNA聚合酶：具有较高的热稳定性；在相当宽的温度范围内都能催化核苷酸聚合，但速度有所不同，在7075其活性最高；没有3 5的外切酶活力，因而对核苷酸的错误掺入不具校正功能，这也是Taq 的致使缺点，在使用该酶的PCR扩增反应中，每次循环碱基错配的概率约为210-4；该酶属于Mg2+依赖型。模板DNA：适宜的模板量是保证特异性扩增的前提，一般需含有102105个被检基因拷贝。引物：引物浓度，一般为0.10.5umol/L。引物浓度过高，易引起错配和产生非特异性扩增，还易生成引物二聚体。dNTP：dNTP浓度愈高，则聚合反应速度加快，但碱基错配率增加；另外，反应中4种底物浓度应相同；由于底物核酸具有较强的酸性，使用时应将底物原液用NaOH调至pH7.0。缓冲液：PCR反应缓冲液一般含有1015mmol/L Tris-HCl、50mmol/LKCl、1.5mmol/LMgCl2。其他成分：反应体系中还含有100ug/ml的白明胶或BSA小牛血清，也有加入非离子去污剂TritonX-100或Tween20，其目的是稳定TaqDNA聚合酶。为防止反应时液体挥发，反应体系的液面上加有矿物油。使用具加热帽的PCR仪时，可不必加矿物油。,39,5、循环参数,PCR扩增中，变性、退火、延伸三步构成一个循环，这三步是分别在三种温度条件下进行，由PCR扩增仪自动完成：变性：第一循环前有一个较长时间的变性，其目的是让双链模板DNA充分解链，以及使样品DNA中含有的少量蛋白质失活。循环中的变性时间一般不宜太长，多采用9430秒。退火：退火的温度及时间取决于引物的长度、GC含量、引物浓度及引物与模板的配对程度。一般PCR扩增中退火时间常设置在30秒至2分钟。延伸：延伸温度由使用的聚合酶的最适活性温度决定，Taq DNA聚合酶：在7075其活性最高，多选用72，循环时11.5分钟。在循环结束后，应设置一次较长时间（8分钟左右）的延伸，以保证扩增出来的片段都延伸完整。循环次数：循环次数主要取决于DNA模板的浓度及待扩增片段（目的片段）在模板中的含量，如果扩增体系中目的片段的起始分子数目很少，增加循环次数，可明显增加产物量。但PCR扩增反应并不是无限的，在循环的起始，产物呈指数级数增长，但经过一定次数的循环后，产物不再呈指数增长，而是进入线性或静止状态。,40,6、扩增产物检测,扩增反应后，将反应物进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙稀酰胺凝胶电泳（当目的片段小于100bp时）分离，以溴化乙锭染色，置紫外透射仪观察，若凝胶上出现明显条带即为扩增的产物。,41,第五节几个名词,42,1、基因扩增（gene amplification）：DNA某一区段可单独取出进行复制，快速增生，形成大量的DNA片段以满足特殊需要。2、限制酶（restriction enzyme）：是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列并由此切割DNA双链结构的水解酶。3、反义技术（antisense technology）：应用碱基配对的原理，以体内表达某种特定蛋白质的靶基因为基础，人工设计一段与之互补的基因片段封闭该靶基因，直接阻断该蛋白质的产生，称为反义技术。4、反转录酶（reverse transcriptase,RT）：是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。5、连接酶（ligase）：是一种能够催化DNA中相邻的3OH和5磷酸基未端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA拼接起来的酶。6、cDNA文库（cDNA library）：是指以mRNA为模板，在反转录酶及其他一系列的催化作用下所获得的双链cDNA，经过与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构建成包含着相应基因编码序列的一群克隆。,43,7、基因组文库（genomic library）：用限制性内切酶切割整个基因组DNA，把所得的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。由此而得的克隆中每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段。这样一套克隆称为基因组克隆，而这些克隆中的一套基因组DNA片段则叫基因组文库。8、基因工程（gene engineering）：是指采用类似工程设计的方法，人为的在体外将核酸分子插入质粒、病毒或其他载体中，构成遗传物质的新组合，并将它转移到原先没有这类分子的寄主细胞中扩增和表达。9、胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）：是指从哺乳动物胚胎囊胚期内的细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，这种细胞具有发育的多能性，能够分化出各种组织。,44,11、遗传病（inherited disease）：是指生殖细胞或受精卵内的遗传物质发生改变而引起的疾病。12、先天性疾病（congenital disease）：即在胎儿出生前，由于染色体结构或数目异常，或基因的点突变，在婴儿出生时就显示的症状，如：先天愚型、血友病、白化病等。13、家族性疾病（familial disease）：在亲代和子代中都有患者，或是正常父母所生子女中出现一个或一个以上的同类疾病的患者，这就是由于从共同祖先继承了相同的致病因素所致。14、染色体病（chromosome disorder）：由于染色体的结构和数目异常而导致的遗传性疾病称为染色体病。15、基因诊断（gene diagnose）：就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。16、基因治疗（gene therapy）：基因治疗是用正常的基因整合入细胞，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。目前从广义来讲，将某种遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病的目的，也谓之基因治疗。,