茂名地区新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变型研究.docx

茂名地区新生儿葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症基因突变型研究李富，林丽琴，魏林燕，陈海玲，吴春红茂名市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心（广东省，茂名市，525000）【基金课题】：广东省茂名市科技计划项目项目名称：茂名地区新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氯酎缺乏症基因突变型研究项目编号：0131通讯作者：林丽琴O摘要目的：探讨广东省茂名地区新生儿葡萄糖4-磷酸脱氢函缺乏症（G6PD）基因突变类型及特征。方法：选取2018年1月至2019年11月我院召回的经茂名市新生儿疾病筛查中心筛查的G6PD可疑阳性新生儿785例,采用G6PD/6PGD荧光比值法法检测G6PD酶活性；采用多色探针荧光PCR熔解曲线法（MMCA）对新生儿干血斑样本进行G6PD基因突变检测。结果：785例新生儿中检出酶活性缺乏者625例，占79.62%,男性和女性醉活性正常、中度缺乏和重度缺乏新生儿比例存在显著差异（P<0.05）:785例新生儿中共检出706例G6PD基因突变，总突变率89.94%,共检出10种单一基因突变类型，占97.17%,共检出14种复合基因突变，占2.83%,其中c.1388G>A、c.1376G>T和c.95A>G是居前三位的热点突变类型，合计占78.90%：99例男性G6PD基因突变样本，均表现为G6PD酹活性缺乏,207例女性G6PD基因突变样本中,56.04%表现为G6PD酶活性缺乏，43.96%G6PD酶活性正常C结论：c.1388G>Ac.l376G>T和c.95A>G是茂名地区G6PD缺乏症的热点突变，G6PD基因型和表型致性存在明显的性别差异，在男性患儿明显更高；单独酶活性检测易导致女性杂合突变漏诊，应结合基因突变综合分析以提高检出率。关键词葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症：新生儿；基因突变：荧光PCR溶解曲线法Studyongenemutationofglucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiencyinneonatesinMaoming1.ifu,Linliqin,Weilinyan,Chenhailing,WUChUnhOngMaomingWomenandChildren*SHealthHospitalNeonatalDiseaseScreeningCenter,Maoming,GuangdongProvince.AbstractObjective:Toexploregenemutationtypesandfeaturesofglucose-6-phosphatedehydrogenase(G6PD)deficiencyinneonatesinMaoming,Guangdong.Methods:Atotalof785suspectedG6PD-positiveneonatesscreenedbytheNeonatalDiseaseScreeningCenterofMaomingCitywereselectedfromJanuary2018toNovember2019andrecalledbyourhospital.G6PDenzymeactivitywasdetectedbyquantificationmethodofenzymeactivitygenemutationtestwasconductedfordriedbloodspot(DBS)samplesbymulticolormeltingcurveanalysis(MMCA).Results:Amongthe785neonates,therewere625caseswithenzymeactivitydeficiency(79.62%).Thereweresignificantdifferencesinproportionofneonateswithnormal,moderatelydeficientandseverelydeficientenzymeactivitybetweenthemaleandthefemale(P<0.05).Amongthe785neonates,therewere706caseswithG6PDgenemutations,withtotalmutationrateof89.94%.Therewere10kindsofsinglegenemutation(97.17%),and14kindsofcompoundgenemutation(2.83%).Thec.1388G>A,c.1376G>Tandc.95A>Gwerethetopthreehotmutationtypes,accountingfor78.90%intotal.AmongtheG6PDgenemutationsamplesfromthe99males,therewaslackofG6PDenzymeactivity.AmongtheG6PDgenemutationsamplesfrom207females,therewere56.04%ofthemwithlackofG6PDenzymeactivity,and43.96%withG6PDnormalenzymeactivity.Conclusion:c.1388G>A,c.l376G>Tandc.95A>GarehotmutationsofG6PDdeficiencyinMaoming.TherearcsignificantgenderdifferencesinconsistencybetweenG6PDgenotypeandphenotype,whichissignificantlyhigherinthesingledetectionofenzymeactivityiseasytoresultinmisseddiagnosisofheterozygousmutationsinthefemale.Thecomprehensiveanalysisofgenemutationshouldbecombinedwithtoimprovedetectionrate.KeywordsGlucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiency;NeOnate;GenemutationMulticolormeltingcurveanalysis葡萄糖-6-磷酸脱氢前(Glucose-6-phosphatedehydrogenase»G6PD)缺乏症一种伴X-连锁不完全显性遗传病,一般情况下患者并不表现出典型的临床症状，但在特定诱因下，如感染，食用蚕豆或服用具有氧化作用的相关药物(磺胺类、伯氨瞳咻类等)时，患者可出现急性溶血性贫血、黄疸等症氏叫据统计，世界批注A讣经批注A2:筛查批注 IA3）:我；：.:'i的可疑G6PD阳性新生儿785例，其中女性225例，男 性560例：年龄8h22d.平均<8.31 ±2.53） <1：临床表 现为批注A4:同时进行批注（A5:删除批注A6J:标本采集：新生儿入院后于足跟外恻或内侧 处采血，滴加在采血淀纸上，共采集3个直径不小于 8mm的血班，自然晾干后，行G6PD/6PGD荧光比值法 检测G6PD酶活性：剩余血斑放入清洁塑料袋内密封， 于4C条件卜.保存,待进行新生儿G6PD基因突变检测.范围内G6PD缺乏症发病率达4.9%,并表现出明显的地域差异，在我国呈“南高北低"分布H（广东省是G6PD缺乏症高发地区，茂名地区20082018年的新筛中心筛查数据显示，G6PD阳性率达7.58%,但目前茂名地区新生儿G6PD基因突变特点尚未见诸报道。本研究采用多色探针荧光PCR溶解曲线法（multicolormeltingcurveanalysis*MMCA）对广东省茂名市新生儿G6PD基因突变进行检测，以期了解本地区新生儿G6PD基因突变类型及特点，为本地区新生儿G6PD缺乏症诊断和防治提供依据。现报道如下。1资料与方法1.1 一般资料本研究选取2018年1月至2019年11月坡院召回的经茂名市新生儿疾病皤乙杳中心筛查的G6PD可疑!阳性新生儿785例，其中女性225例，男性560例；年龄8h22d,平均（8.31+2.53）d；临床表现为病理性黄疸，ABo溶血,贫血等：在获取监护人充分知情同意后，同时!进行b6PDiW活性检测（G6PD/6PGD荧光比值法）和基因突变检测（MMCA法）。I1.2 方法I（1）标本采集：新生儿入院后于足跟外侧或内侧处采血，滴加在S&S903采血滤纸上，共采集3个直径不小于8mm的血斑，自然晾干后，行G6PD/6PGD荧光比值法检测G6PD酶活性：剩余血斑放入清洁塑料袋内密封，于4"C条件卜.保存，待进行新生儿G6PD基因突变检测。（2）G6PD酶活性检测：采集足跟静脉血，采用G6PD/6PGD荧光比值法检测G6PD酶活性，使用AutoTRFIA-2自动荧光免疫分析仪进行检测，试剂盒购自广州市丰华生物工程有限公司，严格按说明书进行检测。结果判定：G6PD6PGD0.95为正常，0.7G6PD6PGD<0.95为轻度缺乏，0.5G6PD6PGDV0.7为中度缺乏，G6PD/6PGDV0.5为重度缺乏。（3）多色探针荧光PCR熔解曲线法检测G6PD基因突变：采集的干血斑使用打孔器打下2个3mm纸片，采用Lab-Aid824型全自动核酸提取仪（厦门致善生物科技有限公司）提取DNA样本，DNA试剂盒为配套试剂盒，按说明书步骤严格执行。提取样本采用实时荧光PCR扩增仪扩增后，应用G6PD基因突变检测试剂盒（厦门致善生物科技有限公司）检测。参照试剂盒说明书对样本基因型进行判读，该试剂盒可用于检测中国人群常见的16种G6PD基因突变类型。1.3 统计学方法使用SPSS20.0软件进行数据统计，计数资料以率表示，采取/检验。所有检验均采取双侧检验，检验水平a=0.0502结果2.1G6PD酶活性检测结果785例新生儿中检出酶活性缺乏者625例，占79.62%,在男性和女性酶活性正常、中度缺乏和重度缺乏新生儿比例存在显著差异(P<0.05),具体见表1。表1G6PD酶活性检测结果(例，%)组别正常轻度缺乏中度缺乏重度缺乏男(n=560)51(9.11)I(0.18)97(17.32)411(73.39)女(n=225)109(48.44)17(7.56)31(13.78)68(30.22)Z2值150.05638.9881.447125.765P值0.0000.0000.2240.0002.2茂名地区新生儿G6PD基因突变情况茂名地区785例新生儿样本中共检出706例G6PD基因突变样本，男性499例，女性207例，总突变率89.94%(706/785)；共检出IO种单一基因突变类型，占97.17%(686/706):共检出14种复合基因突变，占2.83%(20/706):其中占比排前三位的分别是c.1388G>A、c.I376G>T和c.95A>G,合计占78.90%(557/706)。见表2。表2706例新生儿G6PD基因突变情况(例)突变类型男女合计比例(%)c.!388G>A1647824234.28c.1376G>T1378622331.59c.95A>G31619213.03c.871G>A4020608.50c.392G>T1021314.39c.1024C>TIl11223.12c.487G>A1450.71c.1360C>T2240.57c.517T>C1340.57c.l(X)4C>A2I30.42c.95A>Gc.1388G>AO440.57c.871G>Ac.l376G>TO220.28c.1388G>Ac.1376G>TO220.28c.95A>Gc.87lOAO220.28c.1024C>Tc.1388G>AOI10.14c.1376G>Tc.1388G>AO110.14c.1376G>Tc.519C>TO110.14c.1388G>Ac.392G>TO110.14c.871G>Ac.392G>TO110.14c.95A>Gc.392G>TO110.14c.1376G>Tc.392G>TOI10.14c.!388G>Ac.519C>TOI10.14c.871G>Ac.519C>TO110.14c.95A>Gc.lO24C>TO110.142.3706例G6PD基因突变新生儿基因型和表型一致性分析499例男性G6PD基因突变样本，均表现为G6PD酶活性缺乏，207例女性G6PD基因突变样本中，56.04%(116/207)表现为G6PD粉舌性缺乏，43.96%(91/207)G6PD酶活性正常.见表3。表3706例基因突变新生儿基因型和表型分析(例，%)基因突变G6PD酶活性正常缺乏男(n=499)O(0.00)499(100)女(n=207)91(43.96)116(56.04)3讨论G6PD缺乏症主要起因于G6PD基因突变，进而导致酶活性缺乏，是新生儿高胆红素血症的主要致病原因，并以病理性黄疸、溶血性贫血等为主要临床症状。目前临床上G6PD缺乏症主要以预防症状发生和对症治疗为主。因此，对高发地区新生儿G6PD缺乏症进行筛查、明确诊断，进而通过积极预防、控制诱因以期尽可能减少疾病对患儿健康的损害。酶活性检测法由于操作便捷，是目前临床上多数医院诊断G6PD缺乏症的方法之一，但该方法受较多因素影响，对于女性杂合子的敏感性较低，存在一定漏诊率。目前G6PD缺乏症诊断的金标准是直接明确突变的位点和性质，为临床提供准确的诊断依据，也可指导患儿避免接触易导致溶血的食物和药物，有效地避免了急性溶血性贫血及由此导致的高胆红素血症的发生。近年来，G6PD基因突变检测中MMCA法应用日益增多，该方法对国人常见的16种G6PD基因突变类型检测具有较高的灵敏度、特异度，同时其批量检测能力、短时耗、结果易判读等特点提高了检测效率E九本研究采用MMCA法从785例疑似G6PD缺乏症新生儿中检出706例G6PD基因突变样本，其中499例男性突变患儿全为G6PD酶活性缺乏，男性患儿的基因型和表型100%吻合；而检出G6PD基因突变的207例女性患儿中，116例表现为G6PD活性缺乏，余91例则表现为正常G6PD活性，且均为杂合突变，提示G6PD基因型和表型一致性存在明显的性别差异，在男性患儿明显更高，与刘秀莲等研究结果相符，这种差异由G6PD缺乏症的遗传特点决定，女性杂合子即可表现为G6PD活性缺乏，也可表现为G6PD活性正常”叫由此可见单一的酶活性检测易导致此类患者漏诊，增加后代患病风险。另外，本研究中酶活性重度缺乏的患儿占比较高，主要由于c.1388G>A>c.1376G>Kc.95A>G和c.871G>A等II类变异占主导地位，合计占87.39%,根据世界卫生组织G6PD基因突变相关表型分类，通常11类变异导致的G6PD残留酶活性不足10%,"o据相关报道1网，c.1388G>A、c.1376G>T和c.95A>G是国人G6PD基因突变的最常见类型。本研究发现广东茂名地区也同样如此,在所有突变类型中，此三者按由高至低顺序居前三位，且合计占总突变人数的78.9%,与彭瑛等IW报道的中国西南三区G6PD主要突变情况相一致，但茂名地区c.1388G>A.c1376G>T突变型占比相比更高；此外，与唐芳等I报道的广州地区G6PD主要突变情况较为一致，但茂名地区复合突变比例较高。从性别方面考虑，不论男性或是女性患儿，c.1388G>A和c.1376G>T突变型均处于前两位，而第三位有所不同，男性为c.871G>A,而女性患儿为c.95A>G,相关研知指出性别可能是G6PD基因突变类型的影响因素，当然木研究也可能由于检测样本有限，可考虑进行扩大样本进行研究论证。另外，本研究中有10例酶活性缺乏的患者并未检测出G6PD基因突变，这可能与这些样本的基因突变不在试剂盒检测参数范围内，因此在条件允许情况下可考虑通过基因测序来确定新的或少见的G6PD基因突变类型。批注A7J:结合该病为X连锁不完全显性遗传的特点， 应在高发地区女性孕产妇中增加该项目检泅，以预防新 生儿i胆红索的发生。综上所述，c.1388G>A、c.1376G>T和c.95A>G是茂名地区G6PD缺乏症的热点突变，G6PD基因型和表型一致性存在明显的性别差异，在男性患儿明显更高；单独酶活性检测易导致女性杂合突变漏诊，帖合该病为X连锁不完全,显性遗传的特点，应在高发地区女性孕产妇中增加G6PD基因突变检测，以预防新生儿高胆红素的发生。参考文献1FuC,LuoS,LiQ,etal.Newbomscreeningofglucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiencyinGuangxi,China:DeterminationofoptimalcutoffvaluetoidentifyheterozygousfemaleneonatesJ.SciRep,2018,8(1):833.HarrellEJ,RueangweerayutR,GreenJA,etal.HcmolyticPotentialofTafenOqUineinFemaleVolunteersHeterozygousforGlucose-6-PhosphateDehydrogenase(G6PD)Deficiency(G6PDMahidolVariant)versusG6PD-NormalVbIunteersUJ.AmJTropMedHyg,2017,97(3):702-711.3NkhomaET,POolCC,Vann叩PagariV,etal.Theglobalprevalenceofglucose-6-phosphatedehydrogenasedeficiency:Asystematicreviewandmeta-analysisJ.BloodCellsMolDis,2009,42(3):267-278.4JZhangJ,CuiY,WangX,etal.PrevalenceofGlucose-6-PhosphateDehydrogenaseDeficiencyinSichuan,ChinaJ.ClinLab,2018,64(3):383-386.5龙健灵，董福昌，石思，等.广东地区G6PD缺乏症的临床流行病学调查J齐齐哈尔医学院学报,2015,36(16):94-95.6国家卫生健康委临床检验中心新生儿疾病筛查室间质评专家委员会.新生儿葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症筛查与诊断实验室检测技术专家共识J中华检验医学杂志,2019,42(3):181-185.严提珍，钟青燕，唐宁，等.多色探针荧光PCR熔解曲线法在G6PD基因突变检测中的临床应用评价J.中华医学遗传学杂志,2014,31(2):156-162.8 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