眼科真菌性角膜炎诊疗技术.docx

眼科真菌性角膜炎诊疗技术真菌性角膜炎(fungalkeratitis)是严重的致盲性眼病，由于发病与植物外伤有关，中国是农业大国，目前真菌性角膜炎已成为我国部分地区首位的感染致病菌。一、真菌的一般特性真菌是一种真核细胞微生物，细胞结构比较完整，有细胞壁和完整的核，少数为单细胞，大多为多细胞，由丝状体和抱子组成。真菌种类繁多，有10余万种，引起人类疾病约200余种，有报道70余种可引起角膜的感染。二、真菌的生物学特性真菌与细菌在结构、形态及组成上有很大的差别。真菌比细菌大几倍至几十倍，体外有一层坚硬的细胞壁，一般由四层不同结构组成，最外层是糖菌类；第二层是糖蛋白；第三层是蛋白质；第四层是几丁质的微原纤维。各种真菌细胞壁的结构不完全相同，菌丝与抱子外的细胞壁结构也不相同。单细胞真菌呈圆形或卵圆形，称酵母菌。多细胞真菌大多长出菌丝与电子，交织成团，称丝状菌或霉菌。有些真菌可因环境条件的改变，两种形态可以互变。酵母菌的形态与结构，外形与细胞很相似，以出芽方式繁殖，芽生抱子成熟后脱落成独立体。角膜很少有酵母菌感染。丝状菌能长出菌丝，菌丝延伸分枝，长出抱子，各种丝状菌长出的菌丝与泡子形态不同，是鉴别的重要标志。(一)菌丝真菌的泡子以出芽方式繁殖，逐渐延长至丝状，按菌丝的功能可分为营养菌丝，为部分向下生长深入被寄生的组织或培养基中，吸取和合成养料的菌丝。按菌丝的结构分为有隔和无隔菌丝两类。(二)抱子是真菌的繁殖器官，一条菌丝上可长出多个泡子。在环境适宜的条件下，泡子又可发芽伸出芽管，发育成菌丝体。电子又分；分生抱子：由生殖菌丝末漏细胞分裂或收缩形成，也可在菌丝侧面出芽形成；叶状抱子：由菌丝内细胞直接形成；抱子囊泡子：为菌丝末漏膨大成抱子囊，内含许多抱子。三、致病性(1)致病性感染：主要是一些外源性真菌感染，角膜感染以外源性为多见，通过机械刺激和代谢产物作用，引起局部的炎症和病变。(2)条件致病性真菌感染：常见于眼科长期应用广谱抗生素和糖皮质激素后继发感染。四、发病机理各种致病性真菌确切的致病因子还不完全清楚。致病性真菌中，只有极少数在一定条件下可使正常人致病，多数发病则与全身或局部的防御功能障碍有关。机体对真菌的防御功能包括非特异性和特异性两方面。（一）对真菌的非特异性防御功能人类对真菌的非特异性防御功能包括屏障因素、体液因素和细胞因素。1.屏障因素屏障因素指角膜上皮防御功能。完整的正常角膜上皮能防止真菌侵入。有报道正常人结膜囊内培养真菌的阳性率为10%60%不等。但这些人并没有发生真菌性角膜炎，只有角膜上皮损伤后才容易招致真菌感染。真菌一旦突破屏障因素，其他非特异的和特异的防御功能即被启动。如果真菌未能被机体排出或消灭，下述各种非特异的和特异的防御功能就可能形成病理反应，即真菌性角膜炎。2 .体液因素具有非特异防御功能的体液因素指血液、淋巴液、细胞间液、泪液中所含的各种抗微生物的分子，包括体液中的补体系统、溶菌酶、干扰素、各种细胞因子等。补体激活的旁路途径可能被真菌多糖所激活而产生C3b、C3a、C5a等。C3a、C5a对中性粒细胞有趋化作用，且能使肥大细胞释放各种炎症介质。补体经典途径的激活，主要由抗原、抗体复合物启动。3 .细胞因素人体非特异性免疫细胞包括粒细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和肥大细胞等。中性粒细胞常见于真菌侵入处，可能因真菌本身能释放趋化因子；或因真菌激活补体旁路途径，产生C3a和C5a（C3a和C5a不但本身有趋化作用，并能使肥大细胞释放各种炎症介质）。中性粒细胞能吞噬真菌，并通过髓过氧化酶依赖性氧化系统而杀死真菌；中性粒细胞还能通过髓过氧化酶非依赖活性而杀死真菌。当真菌或其产物中的抗原初次进入机体时，抗原呈递细胞摄取、加工抗原后，在淋巴系统内增殖。已致敏的特异性T细胞再循环到真菌侵入部位时，再次受到抗原呈递细胞表面的特异性真菌抗原的刺激，进行克隆增殖，释放各种淋巴因子。并招致各种淋巴因子聚集于局部，造成病理改变。这种病理改变可能消灭真菌而自愈；也可能因未能消灭真菌而长期存在，甚至波及全身其他部位。（二）真菌与角膜的黏附在真菌感染中的作用对许多真菌来说，黏附于宿主上皮的能力是其在宿主中集落形成及侵入体内的前提，也是感染发生的首要步骤，进一步黏附于细胞外基质（ECM）是感染扩散的必要条件。研究表明白念菌可与多种ECM成分如纤维连接蛋白（fibronectin,FN）基膜连接蛋白（laminin,LN）、I型、IV型胶原、纤维蛋白原、明胶和补体结合，白念菌与ECM结合能力的强弱与其致病性成正比，说明与ECM的黏附能力为白念菌重要毒力因子。烟曲霉在体内体外可与多种ECM成分结合，LN和IV型胶原是构成肺泡上皮和毛细血管内皮下基底膜的主要成分，当上皮受损时，基底膜成分暴露，同时损伤后炎症反应导致纤维蛋白原合成增加并沉积于上皮表面,烟曲霉与这些成分接触并结合从而引起烟曲霉肺病的发生。真菌与宿主组织的黏附机制包括特异性配-受体反应和广泛的非特异性理化反应。研究证实白念菌、烟曲霉通过表面的多肽分子(受体)识别结合宿主细胞上的底物(配体)，这种结合具有特异性和可饱和性。刀豆素A(Con-A)结合实验显示白念菌上与纤维蛋白原和LN结合的受体蛋白为甘露聚糖蛋白(mannoprotein,MP)oMP存在于大多数真菌细胞壁外层，可占细胞壁干重50%,扫描电镜发现烟曲霉菌与Iaminin结合受体分布于静息电子外层，SDS-PAGE分析显示此受体为胞壁上一种分子量为72kD的糖蛋白。研究还显示烟曲霉菌与纤维蛋白原和Iaminin以及C3结合的受体有同一性，受体结合于纤维蛋白原的D区和Iaminin的Pl区。烟曲霉泡子除与纤维蛋白原和Iaminin有高亲和力外，还可结合纤维连接素及胶原成分，与纤维连接素结合受体分子量为23kD和30kD的多肽，且识别依赖于RGD序列。细胞壁外层结构对袍子黏附性能起重要作用。成熟有色素的烟曲霉泡子表面可见多量棘状突起，其无色素突变体抱子表层光滑，这种抱子疏水性明显下降，对ECM黏附能力明显下降，同时对氧化剂敏感，对鼠侵袭力下降。由上可见，真菌依靠其特有的分子结构与特定宿主组织发生黏附，黏附在疾病的起始及扩散中起重要作用。通过抑制真菌表面特异性受体或封闭宿主表面配体，破坏真菌疏水性，阻止泡子成熟和棘状化，可以阻止真菌对宿主组织的黏附，从而阻止疾病的发生发展。（三）真菌分泌的酶类与角膜感染的关系研究证实许多真菌在感染宿主的过程中，通过分泌一些特异性酶降解破坏宿主细胞膜成分以利侵袭扩散，病原性真菌分泌的酶类是构成其侵袭力的重要部分，可分为两大类：降解磷脂的磷脂酶和降解肽类的蛋白酶。GhannoumMA提出分泌酶类可认为是致病性真菌（例如白色念珠菌）的完整的发病机理，说明酶类在白色念珠菌致病过程中发挥重要作用。其中主要为蛋白酶、磷脂酶。1 .磷脂酶在白色念珠菌、曲霉菌发病机理中的研究磷脂酶在致病真菌的形态转换和毒力方面起重要作用。磷脂酶D在真菌形态转换过程中激活。现在已知磷脂酶B是白色念珠菌的毒力因素。近来研究证明在白色念珠菌、曲霉菌致病过程中细胞外磷脂酶作为一潜在的毒力因素而存在。Gha-nnoum的实验表明磷脂酶在白色念珠菌及烟曲霉菌的致病过程中起作用。他们克隆了编码念珠菌磷脂酶的三个基因：CaPLB1,CaPLB2,PLDo利用基因干扰的方法，建立了不能分泌磷脂酶B（磷脂酶B由caPLBl编码）的白色念珠菌基因突变株。患有念珠菌病的小鼠动物模型实验性研究中，磷脂酶B缺失株导致念珠菌的毒力降低,表明磷脂酶B对于念珠菌的毒力是必需的。2 .基质金属蛋白酶在真菌性角膜溃疡发病机理中的研究RamakriShna等人在动物实验研究中，以兔子作为研究工具，研究了黄曲霉菌、茄病镰刀菌以胶原作为唯一氮源的时候，在体外产生细胞外蛋白酶的特征。在感染、未感染的兔子角膜中均可见到基质金属蛋白酶2(MMP-2)o在感染的兔子角膜中发现了基质金属蛋白酶9(MMP-9)o酶抑制试验表明体外真菌培养主要是丝氨酸蛋白酶与金属蛋白酶在起作用。在感染的角膜组织中，MMP-9的表达与多形核细胞密切相关，他们推测激活的宿主角膜细胞或炎症细胞很大程度上可能在真菌感染的角膜中有助于蛋白酶活性的增加，从而导致真菌性角膜溃疡中基质的降解。在可溶性胶原或弹性蛋白作为氮源的培养基中生长的时候，真菌产生丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和基质金属蛋白酶。因此他们推测胶原酶活动是此提取菌株导致角膜严重破坏的中介物质。综上可知，MMPS在茄病镰刀菌、黄曲霉菌等真菌性角膜炎发病过程中发挥重要作用，而这两种真菌是真菌性角膜炎最常见的致病菌种。因此，充分了解MMPs在真菌性角膜炎中所起的作用对于研究真菌性角膜炎的发病机理非常重要。目前已知MMPs在绿脓杆菌性角膜溃疡的发病过程中MMPs的产生受许多细胞因子调节。当MMPs与MMPs抑制剂的比例倾向于MMPs的时候，胶原基质将过多降解，从而导致溃疡形成。MMPS的作用底物不同，为了避免过多的组织损伤，这些酶受到严密的调节。这些酶生成增多将会损伤角膜，参与角膜上皮损伤与溃疡的病理过程。不同病因引起的角膜溃疡的共同特征是丝氨酸蛋白酶和MMPs的活动失调。这些酶不但参与ECM降解和溃疡形成，而且参与角膜的生理愈合过程。因此，理解这些蛋白水解酶的活动及表达调控机制对于开发阻止疾病发展和促进角膜愈合的新型药物是非常重要的。对蛋白酶在真菌侵袭过程中的作用尚有争议。对人及动物烟曲霉性肺病的组织病理学研究显示，未见明显的与真菌侵袭有关的基质胶原、弹性蛋白及血管壁蛋白的降解，推测菌丝通过机械作用穿透组织。但亦有作者认为可能蛋白酶（ALP、PEP）仅分布于生长菌丝的顶端，从而只在局部降解破坏组织蛋白，尚有待于进一步精确定位研究。总之，尚无确切证据表明蛋白酶在真菌感染组织时扮演重要角色，有可能其作用在于使真菌能降解坏死组织作为营养物质从而与其他腐生菌竞争。3 .黑色素已发现多种菌株如曲霉菌、新型隐球菌、巴西芽生菌均可产生黑色素或黑色素样化合物，研究表明黑色素的合成与真菌毒力密切相关，通过黑色素合成酶基因突变产生的数种真菌白化株对小鼠侵袭力下降。烟曲霉产生灰绿色抱子,Jahn证实其抱子色素缺失株表面光滑，易被宿主的防御机制如氧化剂、单核细胞所杀灭，与野生型相比，此突变株对鼠的侵袭力下降。黑色素是一种强效自由基清除剂，研究表明黑色素主要作用机制为保护抱子逃避机体免疫防御系统，如补体C3介导的调理作用、中性粒细胞介导的吞噬作用和氧化系统，从而延长菌株体内存活时间。抑制黑色素的合成可以破坏其逃逸作用从而起到杀菌的作用，临床上应用较广的三嗖类药物即可通过抑制黑色素的合成减慢真菌的侵袭速率。除了上述有相对普遍意义的毒力因子外，各种病原性真菌都有其特有的侵袭方式，如酵母菌的表型转换、曲霉菌的毒素均被证实在其发病机制中起一定作用。多种真菌毒力因子的共同作用引起真菌感染的发生发展。由于真菌感染的发生是由多种真菌毒力因子的共同作用引起，目前常用单个毒力基因分离突变方法不能完全了解真菌侵袭的总体机制，对与发病有关的毒力基因群的调控基因的研究有望进一步明确真菌感染的发病机制。五、感染角膜的途径真菌感染角膜有3种途径：(1)源性：常有植物、泥土外伤史。(2)附属器的感染漫延。(3)内源性：身体其他部位深部真菌感染，血行扩散,大多数。学者认为真菌是一种条件致病菌，因为正常结膜囊内培养出真菌，检查阳性率高达27%,但不发病，只有长期使用抗生素，致结膜囊内菌群失调或长期应用糖皮质激素，使局部免疫力低下或角膜的外伤等情况下，才引起真菌性角膜炎。六、常见的致病真菌有丝状菌包括镰刀、曲霉和青霉菌，酵母菌常见为白色念珠菌，有学者的研究资料表明，造成山东地区真菌性角膜炎的80%为镰刀菌。(一)镰刀菌在培养的条件下，镰刀菌菌落呈绒毛状或棉团样，白色或淡紫色。气生菌丝发达，菌丝有中隔，菌丝的短爪状突起或分子电子座上有大分生泡子，呈镰刀状，纺镰形。常感染角膜的镰刀菌有茄病镰刀菌。茄病镰刀菌镜下特征：小分生抱子卵圆形、椭圆形、短腊肠形、逗点形。浅黄色、黄褐色、褐色、蓝色等，呈假头状着生。大分生抱子近镰刀形、纺锤-镰刀形、纺锤-柱形，稍弯曲，顶细胞短，稍窄或圆钝，有时呈喙状，脚胞明显或无，壁厚，25隔，以3隔者为多。厚壁袍子球形、椭圆形、壁厚，多为端生，少数为间生，有单生、对生或串生等方式尖泡镰刀菌镜下特征：小分生抱子椭圆形或腊肠形，多为橙色，量多。大分生电子纺锤形、镰刀形，有尖的顶细胞及典型的足细胞。以34隔为多。菌丝中有较多的顶生或间生的厚壁袍子，单细胞或双细胞，光滑或粗糙，或有疣状突起串珠镰刀菌镜下特征：小分生泡子量极多，卵形或棍棒形，单细胞，大多数以长链状排列，少数具有假头状排列。大分生抱子36隔，量少，镰刀形、壁薄，顶细胞尖细且弯曲，基细胞足形。无厚壁抱子（二）曲霉菌是一种条件致病菌，正常人对该菌有抵抗力。引起曲霉菌感染的主要因素是机体抵抗力下降。曲霉菌生长迅速，26天即可出现白色绒状或灰绿色菌落。菌丝有中隔，分生抱子垂直生长，梗无横隔，顶部膨大为球形，烧瓶形或半球形顶囊。在我国感染角膜有烟曲、黄曲、黑曲和土曲霉菌，但以前两种菌为常见。烟曲霉菌镜下特征：分生泡子梗绿色，光滑、短，顶囊绿色，烧瓶形，小梗单层，密集，布满顶囊表面2/3,分生泡子球形、近球形，表面粗糙有刺，绿色，分生泡子头短柱状，长短不一黄曲霉菌镜下特征：分生抱子头疏松放射状，继变为疏松柱状。分生抱子梗壁粗糙、无色、微弯曲，近顶囊处略粗大。顶囊烧瓶形、球形、近球形，小梗单层、双层或单双层并存于一个顶囊上，以双层为多。分生泡子球形、近球形、洋梨形，表面粗糙（三）青霉菌培养的菌落可为暗绿色，白色或其他色。表面呈绒毛状至粉末状的织物样外观。菌丝有中隔，直接分化生成分生抱子梗。小梗基部膨大，末端变尖成管状，产生卵形分子抱子。青霉菌镜下特征：37。C培养，见到2.53um圆形、椭圆形醉母样细胞。25。C有分枝分隔菌丝，粗糙有典型帚状枝,双轮生对称。分生电子柄光滑、不形成顶囊，梗基常不平行，分散46个，梗基上有46个小梗，小梗短、直，具有梗茎，顶端着生单链分生抱子，分生泡子光滑椭圆或球形，有泡间连体（四）白色念珠菌为7种念珠菌中致病力最强的一种，培养23天可长生菌落，呈典型类酵母型，呈灰白色或奶油色，表面光滑,菌细胞为卵圆形或球形，2m×4m大小，芽生繁殖（图10-7）o抱子伸长成芽管，不与母菌体脱离，形成较长的假菌丝，芽生抱子多集中在假菌丝的接部位，是常感染角膜的一种条件致病菌。7白色念珠菌镜下特征：芽生袍子球形或椭圆形，可见假菌丝和真菌丝（五）链隔泡霉菌链隔抱霉菌镜下特征：分生抱子梗分隔、分枝或不分枝、较短。分生电子褐绿色或褐黑色，表面粗糙，约（3060）RmX（1415）um,水平或垂直或斜形分隔，以水平分隔多见，常具35个横隔，呈砖格状，抱子排列成向顶性的长链，大小不规律，顶部有一鸟嘴状突起（六）申克袍子丝菌是一种二相性真菌，即可以单细胞或多细胞两种形式出现。培养3-5天可形成菌落，与其他菌落不同，开始为灰白色黏稠小点，逐渐扩大变为黑褐色皱褶薄膜菌落，是一种常见的深部感染真菌，角膜表现为基质炎者多见。七、常见真菌致病机理的病理学特点（一）组织病理学山东省眼科研究所对108例真菌性角膜炎临床表现和行PKP术后角膜组织切片特点的分析。1 .一般病理改变角膜组织为广泛化脓性炎症，大量中性粒细胞浸润，炎症明显处，角膜基质纤维轻者肿胀，排列紊乱，重者基质细胞崩解，失去组织结构，呈凝固性坏死样改变。病灶周围见分离的小脓肿形成。病程长的慢性基质炎可见多核的细胞环绕真菌形成肉芽肿样改变。2 .真菌的生长特征25例角膜组织为明显的3层病理改变，表层为菌丝苔被似地毯样覆盖在角膜的表层，中间为炎症坏死组织，并无真菌菌丝长入，内层为完全正常的角膜组织。这些患者在临床上表现为角膜表层的病灶，面积较大,病程缓慢，角膜基质水肿轻，一般没有卫星灶和免疫环，前房反应轻，角膜刮片易找到菌丝。35例角膜组织片显示真菌为灶性板层生长，菌丝只在病灶处垂直和水平扩散，病灶周围组织炎症细胞浸润，离病灶越远，角膜组织越接近正常。临床上为单个溃疡，常达角膜基质深层，表面常为脂样脓液覆盖，周围卫星灶明显，一般没有伪足，穿透性角膜移植术易切除病灶角膜刮片阳性率较低，采用角膜活检阳性率明显提高。48例角膜组织为全层可见真菌菌丝，菌丝垂直嵌在组织间，且杂乱无章生长，有的已伸入到后弹力层，炎症严重处为凝固性坏死，炎症反应轻处为炎症组织与正常组织相间。临床上患者表现为炎症反应明显，病灶范围广，常为全角膜炎症反应，溃疡周围有明显卫星灶，伪足，病程短而猛，均伴前房积脓。3 .真菌性角膜炎分型通过本组真菌性角膜炎的临床表现结合相应的病理学改变，我们可以把真菌性角膜炎大体上分为2种形式。(1)表层(水平生长)型：真菌为表层地毯式生长，对抗真菌药物效果好，刮片阳性率高，是板层角膜移植的适应证。(2)弥散(垂直和斜行生长)型：为临床较严重的真菌感染，有特异的真菌感染伪足、卫星灶等，抗真菌药物往往无效，板层移植为禁忌，PKP时要尽可能切除病灶外O.5mm范围以上，才能有把握控制炎症。(二)黏附和基质金属蛋白酶与真菌在角膜生长方式的病理学特点不同致病真菌在角膜中存在不同生长方式的可能机制：(1)真菌感染角膜的初始表现为真菌泡子与角膜上皮基底膜的黏附，黏附后组织中MMPs表达迅速增高。真菌泡子对角膜上皮基底膜黏附强度、角膜基质中炎性细胞浸润程度和MMP-9表达强度三者之间呈正相关。(2)不同菌种黏附能力、对中性粒细胞趋化作用以及MMP-9表达的差异，是菌丝在角膜中存在不同生长方式的重要病理学基础。(3)真菌抱子对角膜上皮基底膜的黏附能力以及MMP-9的表达是真菌毒力的重要因素。八、流行病学及病因引起角膜感染的主要真菌菌种在不同地区差别较大。在发达国家及气候较寒冷地区(如美国北部和英国)，最常见致病菌种为白色念珠菌(31.6%48.4%);在发展中国家及气候温暖或炎热地区(如美国南佛罗里达州、印度、尼日利亚等)，以镰刀菌和曲霉菌为主(曲霉菌12%47%,镰刀菌16%62%)o我国广东、河南、河北及山东地区以镰刀菌和曲霉菌为主，其中大部分地区镰刀菌为首位致病菌，占28%65%,其次为曲霉菌，占11%49%;第3、第4位为青霉属(3.6%11.6%)或弯泡霉属(1.2%13.l%)o丝状真菌感染发病前多有植物性眼外伤史，或戴角膜接触镜和既往眼部手术史，酵母菌感染多与机体免疫功能失调有关，如全身长期应用免疫抑制剂或单疱病毒性角膜炎、干燥性角结膜炎、暴露性角膜炎等慢性眼表疾病及长期局部使用糖皮质激素或抗生素病史。九、临床表现相对细菌感染性角膜炎，真菌性角膜炎发病和进展相对缓慢。早期描述其临床性时为角膜相对静止的病灶，但目前临床上滥用抗生素、抗病毒及糖皮质激素类药物后，典型病程的真菌性角膜炎已少见，而临床常见到的真菌性角膜炎的浸润、溃疡发展已较快，有的1周内可感染到全角膜，所以不能以病程作为一个主要临床指标来判断是否为真菌感染。真菌性角膜炎典型的角膜病变：1 .菌丝苔被角膜感染病灶为灰白色轻度隆起，外观干燥,无光泽，有的为羊脂状，与下方炎症组织粘连紧密。菌丝苔被，表现为外观较干燥、表面无光泽，与下方炎症组织粘连较紧密，微高出角膜感染灶2 .伪足在感染角膜病灶周围有伪足，像树枝状浸润。3 .卫星灶为角膜大感染灶周围，与病灶之间没有联系的小的圆形感染灶。4 .免疫环常表现为感染灶周围，有一混浊环形浸润，此环与感染灶之间有一模糊的透明带，此环的出现被认为是真菌抗原与宿主之间的免疫反应。5 .内皮斑约有50%患者可见到角膜内皮面有圆形块状斑,比KP大，常见病灶下方或周围。6 .前房积脓是判断角膜感染深度的一个重要指标，有前房积脓时说明感染已达角膜基质层，有的甚至是部分菌丝已穿透后弹力层。前房的脓液在角膜穿孔前，只有15%30%脓中有菌丝，大部分为反应性积脓，当出现角膜穿孔，前房脓液中高达90%有真菌菌丝存在。伪足均从病灶如树枝状伸出，其末端为足板状真菌性角膜炎的卫星灶是一些与主要感染灶不相连的小感染灶，往往围在大的感染灶周围免疫环并不是所有真菌性角膜炎特有的表现，其特征是在主要感染灶的外面有一环形或半环形浸润灶真菌性角膜炎内皮斑为主要感染灶以外的角膜内皮面上有小的病灶，图像显示裂隙切面部有多个内皮斑真菌性角膜炎感染的病灶大小、深度及感染的真菌菌种与前房积脓的多少有直接的关系十、诊断（一）病史角膜是否有植物性，泥土等外伤史，眼及全身长期应用糖皮质激素及广谱抗生素史。(二)临床表现见上文。(三)角膜的真菌学检查角膜的真菌学检查是确定真菌感染的最终手段，下列的检查中只要一项发现真菌就可确立诊断。1.涂片检查(CornealSCraPing)是早期快速诊断真菌感染的有效方法，随病变进展不同部位重复刮片可提高阳性率。分为光镜检查和荧光显微镜检查两类。特别是KoH湿片法，是简单可行和非常适宜基层医院的方法，但关键是取材和耐心。(1)检查常用染色法1) 10%20%氢氧化钾湿片法：氢氧化钾可溶解非真菌杂质而显示真菌菌丝，阳性率33%46%;取病变明显处角膜组织活检加10%氢氧化钾湿片法检查，阳性率可达97.5%o2) Gram染色和Giemsa染色：能非特异性着染丝状菌胞浆,Gram染色阳性率33%55%,Giemsa染色阳性率27%66%,两者准确性无显著性差异。3) Gomori六胺银(GMS)染色和过碘酸-Schiff(PAS)染色：能特异性着染真菌胞壁。GMS染色特异性最高，辂酸可将真菌胞壁中的多糖氧化为醛，后者使六胺银还原为银，从而在绿色背景下显示出黑色的真菌细胞壁及横隔，全过程需23小时。PAS染色时过碘酸将真菌胞壁多糖氧化为醛,后者与Schiff试剂反应呈红色。（2）荧光显微镜常用染色法1）叫唳橙染色法：能快速检测出真菌，叫嗯橙染料能与真菌DNA结合，在黑色背景下可显示出橙绿色真菌。2）二苯乙烯荧光增白剂（CFW）染色：CFW可与真菌胞壁的几丁质和纤维素紧密结合，使真菌显现为强烈发亮的淡绿色，如加入O.l%Even氏蓝，则可在橘红色背景上更清楚地识别发亮的淡绿色真菌。（3）角膜的刮片检查的操作步骤（10%20%氢氧化钾湿片法）1）角膜刮取物或活检组织，放在清洁的载玻片上。2）10%20%氢氧化钾12滴于标本上，覆以盖玻片。3）先用低倍镜找到标本位置，再用高倍镜观察菌丝和泡子。4）如标本过厚或密度过大，可在弱火焰上微微加温，使杂质溶化后再检。5）可加亮绿、亚甲蓝或优质蓝黑墨水混合染色。注意事项：刮片时应擦去表面坏死组织，刮取真正的病变组织。避免在同一病变处反复刮取，造成角膜的穿孔。结果分析：丝状真菌因菌龄不同，其内容物不同，着色为紫蓝色、红色。念珠菌等芽生细胞及假菌丝染为紫蓝色。2 .组织病理学检查方法(1)角膜活检组织或行角膜移植取下的组织片。(2) 10%甲醛或95%酒精固定，石蜡包埋，切片。(3)碘酸雪夫(PAS)染色，光学显微镜下见丝状菌,类酵母菌染为红色。(3) 咤橙染色，在荧光显微镜下见丝状真菌呈亮绿色，类酵母菌呈橙红色、核绿色，厚膜电子呈红橙色。(5) Gomori染色：银沉积在胞壁上把真菌染成明显的黑色轮廓，菌上中心染成深玫瑰红到黑色背景染成淡绿色。(6) GridIey染色：上状菌或酵母菌染成暗蓝色或玫瑰红，组织深蓝，背景黄色。(7) 荧光染色：钙荧光白染色，该染料是一种非特异性的染料，可结合真菌细胞壁上的多糖和某些原核生物，在不同紫外光下，真菌染成浅蓝或绿色。(8) 2.5%戊二醛固定，做电镜切片，可观察真菌的超微结构。3 .真菌培养和鉴定操作方法(1)常用培养基：沙氏培养基、土豆葡萄糖培养基、巧克力琼脂平板培养基。(2)培养温度：2230oC,温度40%50%。(3)时间：20天1月。真菌的鉴定：依据真菌生长速度、菌落外观、菌丝、泡子或菌细胞形态特征等进行鉴别。菌落形态的观察，观察菌落要注意几个方面：菌落大小、形态、色素、颜色和质地。颜色可从灰黑到鲜黄，绿或白色。黑色是菌上体，分子泡子，胞壁中的黑色素所致。真菌如青霉素可在菌落表面形成带色的液滴。有些真菌可产生可扩散的色素并使培养基着色。小培养：需要观察袍子或分生抱子的特点时需用小培养,因在菌落上分离菌丝会使菌上脱落原始状态而又难以观察。小培养常选用马铃薯琼脂，玉米琼脂或V-8果汁做培养基，所有操作均在超净工作台内，简述方法如下：把玉米琼脂培养基涂在一个约ICm的载玻片上,在玻片的琼脂上接种真菌，并散在与琼脂大小相等的玻片，2225。C避光培养2周，培养成熟后取下盖玻片，可用微火烤固定结构后，封片观察。生理盐水(或水)：可直接观察角膜刮片的标本，缺点是干燥，适用于短时间观察。还可用于观察真菌抱子的出芽现象，先在载玻片上滴一滴生理盐水，接种菌悬液后盖上盖玻片，用凡士林封固，置室温或37。C孵化，24小时观察有无出芽现象。涂片的保存，对KOH等涂片标本需要保存，可在盖片四周用指甲油封固，可达保存数月的目的。过碘酸-雪夫染色(PAS):真菌细胞壁中碳水化合物上的羟基被氯化为醛，醛基与复红形成淡紫红色化合物，这种复合物的颜色被偏亚硫酸钠脱色。如果同时采用适当的组织染色形成对比可使组织中的真菌更易于区别。注意事项：可在培养基中加入抗生素防止细菌污染。真菌培养阳性率较低，应多次或采用几种方法同时进行培养，以提高阳性率。4 .共焦显微镜检查共焦显微镜检查对真菌性角膜炎的诊断，研究结果显示达到96%的阳性率，并能对真菌性角膜炎抗真菌药物治疗的效果进行监控，是一种对真菌性角膜诊断和研究的很好仪器。H"一、治疗1 .药物治疗抗真菌（丝状菌、酵母菌）活性最高的药物，根据其结构中双链的多少分为大多烯类（两性霉素B、制霉菌素）和小多烯类（那他霉素）。多烯类药物与真菌细胞膜中的麦角固醇结合，使细胞膜通透性和电解质平衡改变。大多烯类药物能在细胞膜上形成微孔，引起可逆性电解质平衡紊乱小多烯类药物聚集在细胞膜上，引起细胞膜不可逆性破坏。由于哺乳动物细胞（如红细胞、肾小管上皮细胞等）的细胞膜含固醇，故全身应用时可导致肾脏和溶血等毒性反应。（1）那他霉素（natamycin）：是一种广谱、高效、毒性低的抗真菌药物。对各种丝状菌及念珠菌效果好，抗镰刀菌作用比两性霉素B强。报道其对镰刀菌有效率81%85%,对暗色泡科真菌有效率90%,对酵母菌有效率75%o由于其混悬液角膜穿透性差，对角膜深部感染尤其合并前房积脓者效果不佳，长时间应用存在耐药性问题。一般开始应用时每半小时点眼一次，34天后可逐渐减少用药次数。(2)两性霉素B(amphotericinB)：对曲霉菌、念珠菌和新型隐球菌抗菌活性强，部分镰刀菌(35%)对其敏感，很少有菌种对其产生耐药。目前常用0.l%025%眼药水和1%眼药膏，在开始48小时内1小时点眼一次，其后可逐渐减少点药次数。全身应用因其不能通过血眼屏障且全身不良反应大，一般不提倡使用。(3)嗖类(azoles)：咪康嗖(miconazole)为广谱抗真菌药物，对念珠菌和曲霉菌引起的感染有效，局部应用(10mgml)由于眼内通透性差，疗效较低(对丝状菌感染有效率22%)。酮康嗖(ketoconazole)：抗菌作用与咪康嗖相似，全身或局部应用对镰刀菌、白念菌、隐球菌、芽生菌均有效,对曲霉菌较差。优点为口服吸收好，常规用量可迅速渗透到角膜和前房，一般100200mg,每日一次。氟康嗖(fluconazole)：口服氟康嗖对念珠菌、隐球菌、曲霉菌及球抱子菌感染有效，眼局部应用对白色念珠菌性角膜炎效果好，其他念珠菌和镰刀菌等对其不敏感。优点是全身不良反应低，口服及静脉应用吸收良好，能自由穿透进入眼内，发炎眼中穿透力增强。一般应用0.2%1%眼药水，12小时一次，1%眼药膏，每日一次，还可行结膜下注射，局部耐受性良好；口服或静注每天100ng,疗程68周，与酮康嗖相比，伊曲康嗖能强有力地抑制大多数致病真菌如曲霉菌、念珠菌、隐球菌和组织胞浆菌等，尤其对咪嗖类效果较差的曲霉菌抑菌效果好(80%)o口服易吸收，200mg,每日一次，一般不超过3周，全身不良反应低。(4)免疫抑制剂：研究发现许多真菌的天然代谢产物具有对其他真菌的毒性作用，从而抑制共生真菌的竞争生长。环抱霉素A/(CyclosporineA,CsA),FK506和西罗莫司，它们除可作为免疫抑制剂抑制T细胞激活的信号传导途径，还能作为毒素抑制与其竞争的真菌的生长。氯已定葡萄糖酸盐已广泛应用于临床近40年，对许多革兰阳性细菌、革兰阴性细菌、阿米巴原虫、沙眼衣原体具有抑制作用。临床随机对照观察显示0.2%氯已定溶液治疗轻中度真菌性角膜炎效果优于0.25%和0.5%那特真眼水，尤其对镰刀菌感染有效，对曲霉菌感染效果较差，眼局部耐受性良好，未见组织不良反应，而且价格低廉易得。尤其对于病原菌尚不明确或可疑混合感染的患者，可将氯已定溶液作为一线药物选择。2 .抗真菌药物治疗方案根据临床特征和角膜刮片结果确诊为真菌感染即可开始药物治疗，根据涂片中真菌成分可大致区分丝状菌（菌丝）和酵母菌（抱子或假菌丝）根据真菌培养结果应进一步调整用药。镰刀菌感染首选那他霉素，其他丝状菌感染可选用那他霉素或两性霉素B,酵母菌感染首选两性霉素Bo真菌药物敏感实验尚无统一标准，体外药敏结果与体内对抗真菌药物的敏感性往往不一致,因此对临床用药无指导价值。3 .联合用药5-氟胞咯党与两性霉素B或氟康嗖联合应用有协同作用，能减少药物用量，降低不良反应，并延缓5-氟胞咯唳耐药性的产生。利福平和两性霉素B合用亦有协同作用。伊曲康嗖与两性霉素B或5-氟胞啥唳合用治疗念珠菌、曲霉菌和隐球菌感染有协同作用，伊曲康嗖与氟康哇合用与单用伊曲康嚏效果相同。4 .共焦显微镜在临床抗真菌药物治疗的应用引起真菌性角膜炎的致病菌种种类繁多、临床表现复杂，给临床的诊断和用药带来了困难。山东省眼科研究所通过应用共焦显微镜对38例真菌性角膜炎患者经药物治疗的效果和临床转归进行了观察和分析。（1）治疗前患者的共焦显微镜表现：患者的角膜病灶中央均表现为强烈的反光；角膜周边的浸润区可查到菌丝，菌丝呈弥漫、交错分布；患者的周边浸润区均可发现明显的炎症细胞浸润，炎症细胞的大小不一，边界模糊；未发现正常的角膜基质细胞存在。真菌性角膜炎在治疗前感染灶中央部可见大量的真菌菌丝(2)药物治疗7天时的共焦显微镜检查表现为：病灶中央反光明显减弱，可发现数量不等的菌丝(图10T6)；周边浸润区菌丝减少，且菌丝密度明显降低；角膜病灶中央都可见到大量大小不等的炎症细胞浸润，周边浸润区的炎症细胞数量明显减少；有的患者可见正常角膜基质细胞存在。如共焦显微镜检查发现病灶中央反光增强，周边浸润区菌丝密度明显增加，应及时手术治疗。(3)药物治疗14天时的共焦显微镜检查：治疗14天后，所有患者的溃疡灶均明显减小甚至愈合。荧光素染色发现7位患者角膜上皮完全愈合，只在角膜浅基质层残留有不同程度的云翳；另29位患者仍残留深浅不一的溃疡。共焦显微镜表现为：在原角膜病灶的中央，部分患者的共焦显微镜检查仍可找到少量菌丝和炎症细胞；原周边浸润区均未发现菌丝和炎症细胞；在角膜病灶中央可发现菌丝的患者仍可见到少量炎症细胞存在，但细胞的大小比较均匀，边界清晰；所有患者角膜病灶中央均未发现正常角膜基质细胞存在。(4)药物治疗28天时的共焦显微镜检查：此时所有患者的角膜溃疡已完全愈合，上皮完整，共焦显微镜发现：原角膜病灶中央，9位患者仍可发现极少量菌丝存在，同时伴有少量炎症细胞；原周边浸润区均未发现菌丝及炎症细胞，只见到低反光的灰白色混浊；所有患者均明显或隐约可见正常角膜基质细胞。经治疗7天中央部真菌菌丝密度下降，可见有炎症细胞浸润同一患者抗真菌药物治疗28天后病灶中央偶见菌丝，炎症细胞大大减少(5)停药7天时的共焦显微镜检查：此时有12位患者其角膜已完全恢复透明，其余24位仍残留有不同程度的角膜云翳。共焦显微镜表现为：恢复透明的患者其角膜病灶中央可以见到正常角膜基质细胞，部分患者可见浅灰色混浊;有云翳的患者则见到较浓密的白色混浊，隐见角膜基质细胞;所有患者原周边浸润区均可见到正常的角膜基质细胞，偶有浅灰色混浊。(6)所有患者在随访期间角膜均保持透明，未见复发灶。真菌性角膜炎患者经过一段时间治疗后，其角膜上皮已经完全愈合，这时就必须对患者病情做出准确的判断，根据病灶中是否残留菌丝及活动性炎症来决定是继续维持治疗还是减少用药量甚至停药。共焦显微镜检查可得出准确判断。5 .板层角膜移植治疗真菌性角膜炎(I)手术适应证：对所有真菌性角膜溃疡，除非合并穿孔或有穿孔趋势者，都应先联合多种抗真菌药物进行治疗,并可辅以12次局部清创处理，然后根据治疗的转归、病灶的大小、部位、深度及视力等因素决定是否需行角膜移植手术及选择手术的方式。选择部分板层角膜移植手术的适应证为：药物治疗1周以上无效，同时不合并前房积脓的中浅层溃疡；对药物治疗有效，其中选择经治疗后前房积脓消失，病灶位于角膜基质的中浅层，视力严重下降至0.1以下者，尤其适宜于溃疡直径较大或偏中心的中浅层角膜溃疡。手术方法及围手术期处理：板层角膜移植术治疗真菌性角膜溃疡成功的关键之一是术中彻底清除病灶，术前应在裂隙灯下仔细观察溃疡的深度，确定切除的病变深度，术中应根据溃疡灶的深度用可控制切除深度的负压环钻或普通环钻钻取角膜厚度，争取一次把病灶清除。环钻的直径应在溃疡外水肿区12mm,以保证病灶清除干净。剖切后向植床上冲水，冲洗液应用1：100O的氟康嗖反复冲洗，然后观察植床透明度，从植床透明度决定是否再次剖切。每次剖切时植床一定要干燥，以避免植床反光，植床反光易在剖切时导致穿孔，必要时可多次剖切，因此要求术者具有较娴熟的手术技巧。对术前考虑病灶较深，无确切把握能完成板层移植术者,可同时备有活性角膜供体以防术中发生穿孔或病灶可能为深达全层时改行穿透性角膜移植术。（2）围手术期处理1）术前处理：所有患者入院后均先予局部应用氟康嗖，二性霉素B眼水或那他霉素眼水频繁点眼和相应眼膏睡前包眼，口服伊曲康嗖等抗真菌药物治疗，有前房积脓者加上氟康嗖注射液静滴；每位患者联合行病灶清创12次，除去表层分泌物及菌丝苔被，清创后将抗真菌眼膏涂于病灶表面并包眼。2）术中处理：有条件可采用Hessburg-Barron负压环钻，也可采用普通一次性环钻，环钻直径大于溃疡直径0.5mmo根据术前裂隙灯检查结果判断病灶深度，预先钻取角膜厚度的2/3。若1次剖切不彻底，可从角膜病变周边开始多次行板层角膜切除直至植床透明；85%的患者剖切达角膜厚度的4/5,15%剖切接近角膜后弹力层。7例角膜周边溃疡采用新月形板层角膜切除术。植片直径大于植床直径0.25mmo供体为甘油冷冻保存的角膜，术中去除后弹力层。10-0尼龙缝线间断缝合，线结包埋。3）术后处理；术后3天内每日结膜下注射氟康嗖Img,每晚用抗真菌眼膏及抗生素眼膏包眼，包双眼至植片上皮修复后开始点抗真菌眼水，继续每日口服伊曲康嗖，疗程为包括术前治疗在内不超过3周。术后2周无复发则可停用局部抗真菌药物，单纯滴抗生素眼水。4)术后随访：要求患者于术后每周随诊，1个月后改为每月复诊1次，复诊时注意记录视力及矫正视力、眼压、植片透明性、层间愈合情况等，