第2章 高效液相色谱分析法.ppt

3 高效液相色谱法,仪器分析,定义：,以液体为流动相而设计的色谱分析仪器称为液相色谱仪；采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。组成部分：高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统,本实验室的高效液相色谱仪（岛津 LC-10A）,3.1 流程,3.2 特点,特点：高压、高效、高速、高灵敏度 适用范围广，特别对高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析具有极大的优势。,3.3 主要部件,(1)高压输液泵主要部件之一，用于输送液体流动相。高柱效的固定相粒度很小（10m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一,由高压输液泵实现。可单泵使用，也可双泵使用，双泵可实现梯度洗脱。,信号采集/转换器,A泵,B泵,检测器,(2)梯度洗脱装置,利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。可以根据设定的程序改变溶剂配比，从而改变流动相的极性。,流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：,(3)进样装置,a.准备状态：样品装入样品环，流动相不进入样品环；b.进样状态：流动相流进样品环，将样品带入色谱柱。,(4)高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm，柱长540 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。分离柱填充物的种类多样，分离机理各不相同，可将高效液相色谱法分为：液固吸附色谱法，液液分配色谱法，化学键合色谱法，离子交换色谱法等。（后面详细讲解）,(5)液相色谱检测器,a.紫外-可见光检测器 应用最广，有紫外-可见光吸收的有机化合物均可检测。工作原理类似紫外-可见分光光度计，基于朗伯比尔定率：A=lg(1/T)=kc A-吸光度 c-样品浓度,b.光电二极管阵列检测器,用一组光电二极管同时检测透过样品的所有波长紫外光。它具有以下优点:可得任意波长的色谱图，极为方便;可得任意时间的光谱图，相当于与紫外联用，从而得到时间-波长-吸光度的三维图谱。,紫外光进入流动池，从流动池出来的光再经分光系统、狭缝照射到一组(1024个）光电二极管上，数据收集系统实时记录下组分的光谱吸收，得到三维的立体谱图。,c.示差折光检测器,除紫外检测器之外应用最多的检测器；每种物质具有不同的折光指数；可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数 差值。差值与浓度呈正比。,d.荧光检测器,检测对象：对具有荧光特性的物质进行检测；有的物质本 身无荧光，但可与荧光试剂发生反应生成荧光 衍生物，可用于检测。,高灵敏度、高选择性；对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有明显优势。,1.流动相特性,（a）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（b）亲水性固定相常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（c）若流动相的极性大于固定相的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,（6）液相色谱流动相,常用正相柱：固定相为极性，官能团主要有-CN,-NH2等，后者常称为氨基柱，主要用于极性物质的分离纯化，如蛋白质、氨基酸等。常用反相柱：固定相为非极性，最常用的有ODS柱（C-18柱）填料为十八烷基硅烷，在反相色谱可完成高效液相色谱7080%的分析任务，在生物化学分析工作中应用的最为广泛。,2.流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分；按极性分：极性、非极性；按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。常用溶剂：乙腈、甲醇、水、乙醇、己烷、乙酸乙酯等。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,3.流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。常用溶剂的极性顺序：水(最大)甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),4.选择流动相时应注意的几个问题,（a）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质 长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（b）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。（如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。）,（c）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（d）流动相还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,1 液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography,固定相：为固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂；流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。基本原理：组分在固定相上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；,3.4 主要色谱分离类型与基本原理,有机氯农药残留量分析,固定相：薄壳型硅胶(37 50m)流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：差示折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,2.液-液分配色谱 liquid-liquid partition chromatography,固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反。,液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型载体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100m的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10m以下的小颗粒，化学键合制备柱填料。,（2）表面多孔型载体（薄壳型微珠担体）3040m的玻璃微球，表面附着一层厚度为1 2m的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；,化学键合固定相:稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用 最广、性能最佳的固定相；a.硅氧碳键型：SiOC b.硅氧硅碳键型：SiOSi C c.硅碳键型：SiC d.硅氮键型：SiN,化学键合相色谱法 将各种不同基团通过化学反应 键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上。,4.离子交换色谱 ion-exchange chromatography,固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；基本原理：组分在固定相上发生反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长。阳离子交换：RSO3H+M+=RSO3 M+H+阴离子交换：RNR4OH+X-=RNR4 X+OH-应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,5.尺寸排斥色谱size-exclusion chromatography,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。,高效液相色谱分析的应用,1.茶多酚的检测 高效液相条件：色谱柱：Diamonsil C18（5um，250mm*4.6mm）流动相：等浓度洗脱 CH3OH-H2O-TFA（23：77：0.05）A：甲醇（色谱纯）B：0.05%的TFA水溶液（微孔过滤超声）洗脱程序（先等度再梯度）：23%A（20min）10min 40%A(5min)5min 90%A(5min)5min 23%A 检测波长：280nm 流速：1ml/min 柱温：35 样品含量公式：样品含量=（标品取样量*样品峰面积*标品纯度）/标品峰面积,色谱图,1.25%甲醇溶液,2.23%甲醇溶液,2.图形分析,气相图：存在的问题：峰型不规则，有拖尾现象。可能的原因：色谱柱温度偏低；色谱柱柱效较差；流动 相流速偏低；进样速度慢。解决办法：升高柱温度；对柱子进行老化（高温加 热）；增大流速。,液相图：C-18柱（ODS柱)可能的原因：流动相极性偏大、流速偏小。解决的办法：降低极性，增加流速。,问题：两个峰出峰时间相隔太远。方法：增加流动相极性；增加流动,解决办法：使用梯度洗脱。,液相色谱-质谱联用,课堂作业,什么是梯度洗脱，梯度洗脱的特点及应用。什么是正向柱和反向柱？在正相液相色谱的分离过程中,极性 _ _的组分先流出色谱柱,极性_ _的组分后流出色谱柱。下列几种物质，应选择哪种色谱进行分析？乙醇，玫瑰精油，-淀粉酶，脂肪酸，多糖,