第2章免疫球蛋白.ppt

,免疫球蛋白,（Immunoglobulin,Ig）,1890年Behring 和北里用白喉外毒素免疫动物时发现了抗白喉外毒素的抗毒素即发现了抗体，于1901年获诺贝尔奖。1938年，用电泳方法将血清蛋白分为白蛋白、1、2、及球蛋白等组分，抗体活性主要存在于区，也可延伸到区和2 球蛋白区。,概述：抗体与免疫球蛋白,Porter（英）和Edelman（美）用酶解法和化学断链法，阐明Ab是四肽链结构。年获奖 1957年F Macfarlane Burnet(澳,18991986)Peter B Medawar(英,1915)二人合作,提出抗体形成的选择学说,获得性免疫耐受于1960年获诺贝尔奖。1972年NK Jerne(丹,1912)免疫网络学说,提出一个 B细胞系产生一种抗体于1984年获诺贝尔奖。,1975年G Koehler(德,194619)C Milstein(英,阿根廷,1927)此二人制备了单克隆抗体于1984年获诺贝尔奖。1978年S Tonegawa(日,利根川进,1939)发现免疫球蛋白基因结构,抗体多样性遗传原理阐明了B细胞Ag识别受体（BCR）多样性的产生机制，于1987年获诺贝尔奖。,抗体（antibody,Ab）：B细胞在抗原刺激 下增殖分化为浆细胞，产生的能与相应抗原 发生特异性结合、具有免疫功能的球蛋白。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig):具有抗 体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白。,一、抗体与免疫球蛋白的概念,概念不同 Ab都是Ig,Ig不一定是Ab（Ig包含Ab）Ab是生物学功能上概念,Ig是化学结构上概念,分泌型（secreted Ig,sIg)：分泌进入体液,发挥各种免疫功能。膜型（membrane Ig,mIg）:即B细胞表面抗原受体（BCR），包括mIgM和mIgD。,二、Ab与Ig的区别与联系,三、Ig的存在形式,第一节 免疫球蛋白的结构,一、免疫球蛋白的基本结构,四肽链结构:两条相同的重链（Heavy chain,H链）和两条相同的轻链（Light chain,L链）以二硫键连接而成“Y”字型。其基本结构称单体。,（一）重链和轻链,IgG-IgA-IgM-IgE-IgD-,分 类(class)：同一种属的 Ig，根据重链恒定区氨基酸组成和排列顺序不同，将Ig分为五类或五个同种型：,1、重链（H链，450-550aa，50-75kDa）,亚类(subclass):每类Ig根据其铰链区氨基酸残基的组成和H链二硫键数目、位置的不同，又可分为不同的亚类。如：IgG：IgG1IgG4 IgA：IgA1、IgA2 IgM：IgM1、IgM2,分型（type)：同一种属所有个体内，根据各类Ig L链恒定区（C区）氨基酸组成和排列不同分为两型：型、型（2：1）亚型（subtype)：根据链C区个别氨基酸的差异,将型分为1、2、3、4 四个亚型。,2、轻链（L链，214aa，25kDa）,可变区（variable region,V区）：H链(1/4)和L链(1/2)靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，称为可变区。,（二）可变区和恒定区,V区(VL、VH),HVR（CDR）,HVR1(CDR1),HVR2(CDR2),HVR3(CDR3),FR,FR1,FR2,FR3,FR4,Ig的结构域,Complementarity determining region,CDR,Framework region,FR,VH和VL的3个CDR共同组成Ig的Ag结合部位，决定着Ab的特异性，负责识别及结合Ag。,恒定区（constant region,C区）:H链和L链靠近C端的其余氨基酸数量、种类、排列顺序相对稳定，称为恒定区。,免疫球蛋白的基本结构示意图,*不同类Ig的CH 长度不一：IgG、IgA、IgD：CH1、CH2、CH3 IgM、IgE：CH1、CH2、CH3、CH4*同一种属的个体，所产生针对不同Ag的同一类别Ig，其C区氨基酸组成和排列顺序比较恒定，即免疫原性相同，但V区各异。,易伸展弯曲，有利于Fab段同时结合两个不 同的抗原表位；易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解；有利于Ig分子变构，暴露Ig的补体结合位点；五类Ig或亚类的铰链区不尽相同*IgG、IgA、IgD有铰链区*IgM和IgE无铰链区,（三）铰链区：位于CH1与CH2间，富含脯氨酸,1、Ig分子的两条重链和两条轻链都可折叠 为数个球形结构域(由链内S-S键)，每个结构域一般具有其相应的功能。L链:VL，CL H链:IgG、IgA、IgD:VH，CH1，CH2，CH3 IgM和IgE:VH，CH1，CH2，CH3，CH42、这些结构域的功能虽不同，但其结构相似:桶状或三明治,（四）结构域（功能区）,功能区的作用有：VH和VL是结合抗原的部位；CH和CL上具有部分同种异型的遗传标志；IgG的CH2和IgM的CH3具有补体C1q结合位点，可启动补体活化经典途径；IgG可通过胎盘；IgG的CH3可结合细胞表面的FcR，介导调理作用及ADCC作用。IgE的CH2和CH3可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的IgE Fc受体结合,介导I型超敏反应。,二、免疫球蛋白的其他成分,（一）J链（joining chain）富含半胱氨酸的多肽链 由浆细胞合成 主要功能：将单体Ig分子连接成多聚体。如：IgA二聚体、IgM五聚体 IgG、IgD、IgE常为单体，无J链。,（二）分泌片（secretory piece,SP）含糖肽链合成、分泌细胞：黏膜上皮细胞以非共价键形式结合于IgA二聚体上，使其 成为sIgA 功能*保护sIgA的铰链区免受蛋白水解酶降解；*介导IgA二聚体从黏膜下到黏膜表面的转运。,三、免疫球蛋白的水解片段 木瓜蛋白酶（papain）水解 IgG 2个Fab段(fragment antigen binding,抗原结合片段)1个Fc段（fragment crystallizable,可结晶片段）胃蛋白酶（pepsin）水解IgG F(ab)2 可结合两个抗原表位形成凝集反应。pFc,水解片段意义：*阐明Ig分子生物学作用；*用作生物制品：去掉Fc段，减少超敏反 应发生；*构建基因工程抗体。,第二节 免疫球蛋白的异质性,含义：尽管所有的免疫球蛋白分子在结构上均由V区和C区组成，但不同抗原甚至同一抗原刺激B细胞产生的免疫球蛋白，在其特异性以及类型等诸多方面均不尽相同，呈现出明显的异质性。,Ig异质性表现在1、不同抗原表位诱导的同一类型的Ig，其结合抗原的特异性不同（可变区差异）。2、同一抗原表位刺激所产生的抗体分子，其结合抗原的特异性相同，但恒定区可不同（其H链类别和L链型别也有差异）。,1、类：在同一种属的所有个体内，Ig重链C区所含抗原表位不同，据此可将Ig分为五类，即同种型。2、亚类：同一类Ig其重链的抗原性及二硫键的数目和位置不同，据此可以将Ig又可以分为亚类。,一、免疫球蛋白的类型,3、型：同一种属所有个体内，根据Ig轻链C区抗原性的不同，将Ig轻链分为2种：和，与此对应的Ig分为和两型（2：1）。4、亚型：同一型Ig中，根据其轻链C区N端氨基酸排列的差异，又可分为亚型。型有1 4四个亚型。OZ(+)(或1)：第190位(亮氨酸)OZ(-)(或2)：第190位(精氨酸)Kern(+)(或3)：第154位(甘氨酸)Kern(-)(或4)：第154位(丝氨酸),多样性抗原：自然界存在的抗原数目繁多，每一种抗原分子 的结构又十分复杂，含有多种不同的抗原表位。理论上，每一种抗原表位可诱导产生一种特异性抗体，以及针对同一抗原表位可产生不同类型的抗体。,二、外源因素所致的异质性-免疫球蛋白的多样性,三、内源性因素所致的异质性-免疫球蛋白的血清型,Ig具有两重性，即可以是抗体，也可以成为抗原，表现为三类不同的抗原表位：(一）同种型：存在于同种抗体分子中的抗原表位，是同一种属所有个体Ig分子共有的抗原特异性标志，为种属型标志，存在于Ig C区。鼠-人，兔-人，Ig在种之间的抗原性(强),（二）同种异型：同一种属不同个体间Ig 分子所具有的不同抗原特异性标志，为个体型标志。存在于Ig C区，由同一基因座的不同等位基因所编码，均为共显性。目前已鉴定的人类Ig分子上的同种异型抗原决定基有：Gm、Am、Km Ig在同种不同个体间的抗原性（弱）,人人,（三）独特型（idiotype,Id)：每一B细胞克隆产生的Ig所具有的特有的抗原特异性标志。即使是同一种属、同一个体来源的抗体分子，主要由于其CDR区的氨基酸序列的不同，可显示不同的免疫原性，是每个Ig分子所特有的抗原特异性标志，其表位又称为独特位（idiotope)。存在于V区。（Ig分子间的抗原性）独特型可刺激异种、同种异体以及自体产生相应Ab,即抗独特型抗体（AId或Ab2),Id(idiotype)和AId（anti-idiotype antibody）Id：个体独特型，特异性抗体分子所特有的Id；公有独特型，功能上有关联的Ig所共有的Id。AId:称为Ab2 分为Ab2、Ab2、Ab2、Ab2Ab2：识别并结合Ig（Ab1）骨架区附近的独特型，不影响Ab1与抗原的结合，属于半抗原非抑制性Ab2。,Ab2：识别Ab1上与抗原互补的表位，完全抑制抗原与Ab结合。具有类似抗原的结构，可模拟Ag产生IR，称“内影像”作用。Ab2：结合Ab1上与互补位相关及邻近的独特位，抑制或部分抑制Ab1与抗原结合，属于半抗原抑制性Ab2。Ab2：既识别Ab1骨架区附近的独特位，又识别抗原上的抗原表位，为双特异性抗体，与自身免疫病的发生有关。,第三节 Ig的基因结构及其重排和表达一、胚系基因结构（一）V区基因和C区基因每种肽链的编码基因可分为编码V区的V区基因和编码C区的C区基因两大部分。重链V区基因:是由三种胚系基因片段：V、D、J片段拼接而成轻链V区基因:是由V、J两个基因片段拼接成,BCR/Ig的各个V基因片断之前还有前导序列（L序列），编码前导肽;V区基因的下游是编码C区的C区基因BCR/Ig各条肽链的基因定位于不同的染色体上 H链:14号染色体 链:2号染色体 链:22号染色体,（二）Ig胚系基因结构,二、Ig的基因重排和表达,三、Ig的类别转换（class switching）一个B细胞克隆在分化过程中V-D-J功能性基因片段保持不变，而发生C基因重排，使其表达的抗体分子发生H链类的改变，称为类别转换。B细胞克隆 IgM,IgG,IFN-,IL-4,IgE,S序列：CH基因5一段内部重复序列，使任一C区均可与VDJ单位连接,四、膜型Ig和分泌型Ig,1、Ig(IgM、IgD)既有膜型又有分泌型；2、膜型Ig均为单体；3、膜型和分泌型Ig是在转录加工过程中造 成的。,A、编码Ig羧基端有两种外显子 SC：编码分泌型Ig羧基端 MC：编码膜型Ig羧基端B、基因结构：V-D-J-C-SC-MC-MCa.转录到SC止 编码分泌型Igb.转录到MC止 编码膜型Ig,一、识别并特异性结合抗原二、激活补体三、结合细胞表面的Fc受体（一）调理作用（二）ADCC（三）介导型超敏反应 四、穿过胎盘和黏膜,第四节 免疫球蛋白的功能,一、Ig V区的功能:1、特异性识别、结合抗原 V区的CDR在识别和结合特异性抗原中起 决定性作用 抗原结合价：Ig结合抗原表位的个数 实际意义:*中和效应：中和毒素、病毒，阻止细菌吸附*启动体液免疫应答:BCR（mIgM、mIgD）特 异性识别Ag分子*病理损伤:参与、型超敏反应,2、免疫调节：独特型网络调节3、超抗体活性：Ig除与特异性抗原结合外，还可与核苷酸及超抗原结合，从而发挥多种功能。可能与自身免疫病和抗感染免疫有关。,二、Ig C区的功能,(一）激活补体,Ab(IgM、IgG1-3)与 Ag结合 构型改变 位于CH2/CH3功能区的补体结合位点暴露 激活补体经典途径IgG4、IgA和IgE的凝聚物 激活补体旁路 途径,1、调理作用：IgG 与细菌等颗粒性抗原结合后，可通过其Fc段与巨噬细胞和中性粒细胞表面相应 FcR结合，从而促进吞噬细胞的吞噬作用。,（二）结合Fc受体,2、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC):IgG 与肿瘤或病毒感染的靶细胞结合后，可通过其Fc段与NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞表面相应FcR结合，直接杀伤靶细胞。,IgE的Fc段可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面的高亲和力IgE Fc受体（FcR)结合，并使其致敏。若相同变应原再次进入机体与致敏靶细胞表面的特异性IgE结合，即可使之脱颗粒，释放组胺等生物活性介质，引起型超敏反应。,3、介导型超敏反应,(三）穿过胎盘和黏膜,穿过胎盘：IgG 意义：新生儿抗感染 穿过黏膜：sIgA 意义：黏膜局部抗感染,一、IgG单体分子，少量IgG以多聚体存在；四个亚类；血清中含量最高,约占血清总Ig的75%;半衰期最长(2023天），是再次应答的主要抗体；抗感染的主要抗体；是唯一能通过胎盘的抗体；,第五节 五类免疫球蛋白的特性与功能,激活补体；中和毒素。与细胞表面FcR结合调理作用、ADCC作用能结合SPA 纯化抗体、免疫诊断参与II、III型超敏反应某些自身抗体、封闭抗体也属于IgG,二、IgM 1.占血清Ig含量的510%；2.单体：以膜结合型（mIgM）表达于B细胞表 面，构成BCR 分泌型：五聚体，分子量最大；(凝集作用强)3.个体发育中最早合成和分泌的Ab；4.IgM 不能通过胎盘 脐带血IgM升高示胎儿 有宫内感染；,5.初次体液免疫应答中最早出现的Ab-早期抗感染;6.半衰期:5天-血清中特异性IgM 增高提示有 近期感染；7.激活补体能力强，中和毒素与病毒，促吞噬8.自身抗体（如：类风湿因子）、天然血型Ab 为IgM；9.参与II、III型超敏反应。,1.两种类型：血清型-单体，血清中；与组织Ag有特殊 亲和力,可防止其诱导自身免疫应答。分泌型-二聚体，由J链连接，含上皮细胞 合成的SP,经分泌性上皮细胞分泌 至外分泌液中；有阻抑病原粘附、溶解 细菌、介导ADCC作用、中和毒素与病 毒及免疫排除等作用。2.占血清Ig含量的1015%；,三、IgA,3.黏膜局部抗感染免疫的主要Ab：抗感染：阻止病原体黏附到细胞表面 中和毒素4.婴幼儿从母体初乳中获得sIgA,属重要的 自然被动免疫。,四、IgD 1.单体分子;2.存在形式：分泌型:血清中，不稳定，功能不清;膜结合型:构成BCR,是B细胞发育成熟的 重要标志。未成熟B细胞:mIgM 成熟B细胞:mIgM+mIgD 3.占血清Ig含量的0.2%；4.半衰期:3天。,五、IgE 1.单体分子；2.血清中含量最低(占Ig的0.002%)；3.半衰期:2天；4.黏膜下淋巴组织中的浆细胞分泌；5.亲细胞抗体，介导 I 型超敏反应；6.过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中 特异性IgE水平增高。,第六节 免疫球蛋白超家族,概念与组成 与Ig结构相似、遗传基基同源的一类蛋白分子，它们主要以膜蛋白形式存在于细胞表面，有识别及传递信号的功能，将此类蛋白称为免疫球蛋白超家族。Ig、抗原受体（TCR与BCR）、提呈抗原的分子（MHC与CD1）、粘附分子、IgFcR、CKR及其他成员结构特点跨膜蛋白；胞外区、跨膜区、胞内区生物学功能激发IR、调节免疫、介导细胞间相互粘附、参与Ig转运与分泌。,第七节人工制备抗体,1、制备抗血清-多克隆抗体2、单克隆抗体技术3、基因工程抗体,1、含义：指由多个B细胞克隆产生的针对抗 原物质中多种抗原表位的多种抗体混合物。如:免疫血清（含多种特异性抗体）优点：作用全面,来源广泛，制备容易。缺点：特异性不高，易发生交叉反应。,一、多克隆抗体（polyclonal antibody),多克隆抗体,天然 Ag,免疫动物,多克隆抗体,二、单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）由单一克隆B细胞杂交瘤产生的，只识别抗原分子某一特定抗原表位的特异性抗体。杂交瘤细胞：骨髓瘤细胞-无限增殖；免疫B细胞-合成、分泌特异性抗体。杂交瘤技术-HAT培养基：次黄嘌呤(H),氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。,杂交瘤细胞具有无限增殖和分泌特异性抗体的能力未融合脾细胞（HGPRT+）:不能在体外长 期存活而死亡(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶）未融合的骨髓瘤细胞（HGPRT-）:合成DNA 被氨基蝶呤(A)阻断，又缺乏HGPRT，不能 利用次黄嘌呤(H)合成DNA而死亡融合的杂交瘤细胞（HGPRT+）:从脾细胞 获得HGPRT而能在HAT培养基中存活和增殖,杂交瘤技术的原理,单克隆抗体的制备过程,抗原(多表位)免疫小鼠 骨髓瘤细胞培养 免疫脾细胞 骨髓瘤细胞 细胞融合 HAT培养基 杂交瘤细胞的筛选与克隆化 mAb的大量制备,PEG,优点：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、血清交叉反应少或无 缺点：鼠源性对人具有较强的免疫原性，反复人体使用后可诱导产生人抗鼠的免疫应答（HAMA），导致机体免疫损伤。试图使用相同的技术生产人源mAb未能成功，其主要原因是缺乏合适的人骨髓瘤细胞系，另外，杂交瘤产生人源mAb在技术上还存在着融合难、不稳定、人体不能随意免疫等问题。,三、基因工程抗体(genetic engineering antibody)通过基因重组改良抗体性能 通过噬菌体抗体库技术研制新的抗体原理：借助DNA重组和蛋白质工程技术，按人们的意愿在基因水平上对Ig分子进行切割、拼接或修饰，重新组装成新型抗体分子。,基本思路：将部分或全部人源抗体的编码基因，或克隆到真核或原核表达系统中，体外表达人-鼠嵌合抗体或人源抗体；或转基因至剔除自身抗体编码基因的小鼠体内，主动免疫诱生人源抗体。,根本出发点：解决抗体的鼠源性问题优点：人源化或完全人源的抗体，均一性强，可工业化生产；缺点：亲和力弱，效价不高。,基因工程抗体的种类:对鼠源性抗体的改造噬菌体抗体（将B细胞全套可变区基因克隆出来与噬菌体外壳蛋白基因连接，导入细菌体内使之表达，制备人全套抗体）转基因小鼠制备人源抗体,鼠单抗人源化,小分子抗体,将CH3的C-末端与ScFv的N-末端连接,二硫键稳定的Fv(dsFv),基因工程抗体的种类及其特性,基因工程抗体的应用 抗肿瘤作用 抗感染作用 在器官移植中的应用 抗血栓作用 在自身免疫性疾病中的应用 在中毒性疾病中的应用 在变态反应性疾病中的应用,免疫球蛋白的基本结构示意图,Ig的结构域,