结合态淀粉合成酶Granule-boundstarchsynthaseGBSS试剂盒说明书.docx

结合态淀粉合成酶(GranllIe-boundstarchsynthase,GBSS)试剂盒说明书微量法100管/96样注正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定渊定意义：GBSS(EC2.4.1.21)以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。渊定原理：GBSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP；进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+还原为NADPH,其中NADPH生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比，通过34Onm卜.测定NADPH的增加量，可以计尊GBSS活性。需自备的的仪器和用品：紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸储水。试剂的组成和配制：提取液：液体100mLX2瓶，4保存：试剂一：40mL×l瓶，4C保存；试剂二：粉剂Xl瓶，4tC保存：临用前加入14mL试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20C保存，禁止反复冻融：试剂三：粉剂Xl瓶，4C保存；临用前加入8mL试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20C保存，禁止反复冻融：试剂四：粉剂Xl瓶，4tC保存：临用前加入IOmL试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20C保存，禁止反复冻融：试剂五：液体Xl支，-20*C保存：临用前加入500JL蒸储水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20C保存，禁止反复冻融；试剂六：粉剂Xl支，20tC保存：临用前加入500JL蒸储水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20C保存，禁止反复冻融；粗液制备:称取0.10.2g组织(建议称取约0.1g组织)，加入ImL提取液，冰浴中匀浆。IooOog,4离心Iomin,弃上清，在沉淀中加入ImL提取液充分混匀，置冰上待测。渊定步骤：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm,蒸储水调零。2、在EP管中按顺序加入下列试剂试剂名称(L)测定管样本75试剂二135混匀，3（C保温20min,置.沸水浴中Imin（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却试剂三75混匀，306保温3。1«山，置沸水浴中1min（盅紧，防止水分散失），冰浴冷却，100OOg4七离心Iomin,取上清液（如果一次性测定样本较多，可以将试剂四、五和六按比例配成混合液）上清液150试剂四I(X)试剂五5试剂六5混匀后立即34Onm波长下记录初始吸光度Al和2min后的吸光度A2,计算AA=A2-A1°注意：试剂二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。GBSS活性计算：H.使用微石英比色皿测定的计算公式如下：1、按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生InmolNADPH定义为一个衡活力单位。GBSS（nmol/min/mgprot）=AAV反总÷（×d）xlO（V样XCPr）÷Tx稀释倍数=529×A÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。2、按照样本鲜重计算单位的定义：银g组织每分钟催化产生InmolNADPH定义为一个酶活力单位。GBSS活性（nmol/min/g鲜重）=A×V反总÷（×d）×109÷（W×V样÷V样总）÷Tx稀释倍数=529A+WV反总：反应体系总体积，2.6×104L；:NADPH摩尔消光系数，6.22×1O3L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.075mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min：稀释倍数：1.9；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。b.使用96孔板漏定的计算公式如下：1、按样本蛋白浓度计算：单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生InmolNADPH定义为一个酶活力单位。GBSS（nmol/minmgprot）=QAxV反总÷（×d）乂心H（V样XCPr）÷Tx稀释倍数=1059×A÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。2、按照样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟催化产生InmolNADPH定义为一个酶活力单位。GBSS活性（nmol/min/g鲜重）=AA>V反总÷（d）xl（）9÷（WxV样÷V样总）÷Tx稀释倍数=1059×A÷WV反总：反应体系总体积，2.6×104L;:NADPH摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.075mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2min；稀释倍数：1.9；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。