高良姜素对肺癌细胞H1299的抑制作用及机制研究.docx

高良姜素对肺癌细胞H1299的抑制作用及机制研究廖秀珊海南博鳌一龄生命养护中心检验科，海南琼海571400【摘要】目的探讨高良姜素对肺癌细胞H1299的抑制作用及机制研究。方法取对数生长期的H1299细胞铺板于96孔板中，采用不同浓度高良姜素(0、2.5、5、10、20、40、80molL)处理24h,采用MTT法检测高良姜素对H1299细胞增殖的影响，计算半数抑制浓度(IC50),取0、1/2、1/4、1/8IC50(0、25、12.5、6.25molL)分为高、中、低剂量高良姜素进行后续实验，采用流式细胞术、免疫印迹法检测H1299细胞的凋亡率和Wnt3a、-catenin.Bax、Bcl-2的蛋白表达。结果与对照组相比，580molL高良姜素细胞均可显著抑制肺癌细胞H1299细胞增殖，差异具有统计学意义(P<0.05);采用拟合曲线法计算得到，高良姜素IC5=50molL00molL高良姜素细胞凋亡率、Wnt3a、-catenin>BaX和Bcl-2蛋白表达水平分别为(4.23+0.45)%、(1.77±0.07)>(2.51±0.15)>(0.56+0.09)(1.89±0.12),6.25molL高良姜素细胞凋亡率、Wnt3a、-catenin.Bax和Bcl-2蛋白表达水平分别为(9.02±1.01)%、(0.97±0.11)>(0.99÷0.05)>(0.89÷0.04)>(1.21÷0.09),12.5molL高良姜素细胞凋亡率、Wnt3a、-cateninBax和Bcl-2蛋白表达水平分别为(18.48±2.33)%、(0.56÷0.07)s(O.88±O.ll)s(1.21±0.1D(0.88±0.10),25molL高良姜素细胞凋亡率、Wnt3a、-catenin、Bax和Bcl-2蛋白表达水平分别为(26.44÷1.17)%、(0.31÷0.04)s(0.43±0.05)>(1.79±0.21)、(0.28÷0.07),与对照组相比，低、中、高剂量组高良姜素可促进细胞凋亡率增加，降低Wnt3a.-catenin和Bcl-2蛋白表达水平，升高Bax蛋白表达水平，差异具有统计学意义(P<0.05)°结论高良姜素可以抑制肺癌H1299细胞增殖并促进细胞凋亡，其机制可能与促进Bax的蛋白表达和抑制Wnt3a、-catenin和Bcl-2的蛋白表达有关。【关键词】高良姜素；H1299肺癌细胞；细胞凋亡StudyontheinhibitoryeffectofgalanginonlungcancercellH1299anditsmechanism.LIAOXiu-Shan.DepartmentofLahoratoiyMedicine,HainanBoaoYilingLifeCareCenter,Qionghai571400,Hainan,China!AbstractObjectiveToexploretheinhibitoryeffectofgalanginonlungcancercellH1299anditsmechanism.MethodsTheH1299cellsinthelogarithmicgrowthphasewereplatedina96-wellplate,treatedwithdifferentconcentrationsofgalangin(0,2.5,5,10,20,40,80molL)for24h,andMTTwasusedtodetectgalangalcalculatethehalfinhibitoryconcentration(IC50)ofH1299cellproliferation,andtake0,1/2,1/4,1/8IC50(0,25,12.5,6.25molL)intohigh,medium,andlowthedoseofgalanginwasusedforfollow-upexperiments,andtheapoptosisrateofH1299cellsandtheproteinexpressionofWnt3a,-catenin,Bax,andBcl-2weredetectedbyflowcytometryandwesternblotting.ResultsComparedwiththecontrolgroup,580molLgalangincellscansignificantlyinhibittheproliferationoflungcancercellH1299cells(P<0.05);calculatedbythefittingcurvemethod,galangin/Cso=5OmolL.0molLgalangincellapoptosisrate,Wnt3a,-catenin,BaxandBcl-2proteinexpressionlevelswere(4.23±0.45)%,(1.77±0.07),(2.51±0.15),(0.56±0.09),(1.89±0.12),6.25molLgalangincellapoptosisrate,Wnt3a,-catenin,BaxandBcl-2proteinexpressionlevelswere(9.02±1.01)%,(0.97±0.11),(0.99±0.05),(0.89±0.04),(1.21±0.09),12.5molLgalangincellapoptosisrate,Wnt3a,-catenin,BaxandBcl-2proteinexpressionlevelswere(18.48±2.33)%,(0.56±0.07),(0.88±0.11),(1.21±0.11),(0.88±0.10),25molLgalangincellapoptosisrate,Wnt3a,-catenin,BaxandBcl-2proteinTheexpressionlevelswere(26.44±1.17)%,(0.31±0.04),(0.43±0.05),(1.79±0.21),(0.28±0.07).Comparedwiththecontrolgroup,thelow,mediumandhighdosesofAlpiniagingerItcanpromotetheincreaseofcellapoptosisrate,reducetheexpressionlevelofWnt3a,-cateninandBcl-2protein,andincreasetheexpressionlevelofBaxprotein.Thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).ConclusionGalangincaninhibittheproliferationoflungcancerH1299cellsandpromotecellapoptosis.ThemechanismmayberelatedtopromotingtheproteinexpressionofBaxandinhibitingtheproteinexpressionofWn-cateninandBcl-2.KeyWordsGalangin；H1299lungcancercells；Apoptosis高良姜素即4H-I-苯并毗喃-4-1,3,5,7-三羟基-2-苯基或3,5,7-三羟基黄酮是天然存在于姜科山姜属植物的一种多酚化合物。众所周知，高良姜素在中医药治疗中主要用于抗诱变和抗病毒作用。多项研究发现，高良姜素具有抗氧化、抗炎、抗心肌缺血等生物学功能。近年来研究发现，高良姜素具有抗肿瘤活性和抑制癌细胞生长。高良姜素对多种类型的癌症具有较强的抑制作用，包括大肠癌、肝癌、胃癌等因此，深入研究高良姜素的抗肿瘤作用机制，对于防止肿瘤的发生发展具有重要意义。然而，关于高良姜素抗肺癌的机制尚未明确。本研究旨在观察高良姜素在人肺癌H1299中的作用，并探讨其可能的作用机制。1材料与方法1.1 主要材料肺癌H1299细胞株（中科院上海细胞库），高良姜素（上海纯优生物科技有限公司），Wnt3aP-Catenin、Bax、Bcl-2和GAPDH（美国CST公司），辣根过氧化酶标记二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），1640高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白前（美国GibCo公司），MTT试剂盒、AnneXinV-碘化丙咤（PI）细胞凋亡试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司），流式细胞仪（美国BD公司）,蛋白电泳仪、转膜槽、凝胶成像系统（美国BioRad公司）。1.2 细胞培养将含有10%FBS的RPMI1640培养基加入H1299细胞中，在37、5%CO2条件下培养。常规传代培养，取对数生长期细胞状态良好进行后续实验。1.3 MTT法检测细胞增殖能力取对数生长期H1299细胞按照4x103/孔密度接种于96孔板中，将高良姜素以2.5、5、10、20、40、80molL的浓度梯度对H1299细胞进行干预，溶剂对照组加等体积的0.1%DMSO,同时在空白对照组中不加细胞只加培养液（4孔/组），干预时间为24h。采用MTT试剂盒法检测细胞存活率并计算IC50,实验重复三次。细胞存活率实脸组OD值一个臼对照组OD伯100»对照组OD值一空白对照组OD值X,01.4 流式细胞术检测肺癌H1299细胞凋亡率根据细胞增殖实验结果，加入0、6.25、12.5、25moIL（对照组、低剂量、中剂量和高剂量组）的高良姜素处理H1299细胞24h。将各组细胞，消化、离心后收集细胞，PBS清洗3次后加入500LBindingbuffer重悬细胞，并加入5LAnnexinV和Pl轻轻混匀，避光孵育15min,采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。1.5 WeStemblot检测肺癌H1299细胞中Wnt3a、-catenin>BaX和Bcl-2蛋白表达水平将细胞均匀铺于6孔板中，待细胞贴壁，观察细胞融合度，当细胞融合度达到8090%时，加入对照组、低剂量、中剂量和高剂量组的高良姜素处理H1299细胞24h后收集细胞总蛋白，采用BCA试剂盒法测定蛋白浓度。取30g蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）,湿转，5%BSA室温封闭1h,加入一抗Wnt3a（1：1000）、-catenin（1：1000）、Bax（1：IooO）和Bcl-2（1：1000）4孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10分钟，加入二抗（1：5000）室温孵育2h,TBST洗膜3次，每次15分钟，利用化学发光液显影。采用ImageJ软件进行分析，以目的蛋白/内参蛋白（GAPDH）的灰度值作为蛋白的相对表达量。1.6 统计学方法采用SPSSl9.0统计软件分析本研究中数据。符合正态分布的计量资料以平均值土标准差表示，组内比较采用配对r检验，多组间比较采用单因素方差分析并使用LSD-r法进行多重比较，不符合参数检验的数据比较采用秩和检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1 MTT检测不同浓度高良姜素对H1299细胞的生长抑制作用2.1.1 不同浓度高良姜素对H1299细胞的生长抑制作用不同浓度的高良姜素作用于肺癌H1299细胞24h后，高良姜素均可以抑制H1299细胞增殖（P<0.05）,且随着剂量的增加，抑制增殖作用越强；同时，高良姜素对肺癌H1299细胞的半数抑制浓度为50molL0选取0、25、12.5、6.25molL高良姜素进行后续实验。见表1。表1不同浓度的高良姜素对H1299细胞存活率的影响Concentration(molL)Survivalrate(%,x±s)0100.00±0.792.597.64±2.37590.07÷4.76*1080.88±1.37*2066.27±0.99*4054.27±2.17*8032.23±1.10*F121.232P<0.05注：与OmolL相比，*P<0.052.1.2 细胞形态变化光镜下观察可见随着高良姜素的浓度逐渐增加，细胞形态与对照组相比变小变圆数量逐渐增加，可见大量细胞脱落，且细胞数量逐渐减少，同时细胞形态表现为不规则状态。其提示了高良姜素呈现剂量依赖性抑制肺癌H1299细胞增殖，（见图2）。0 molL 6,25 moL 12.5 molL 25 molL图2不同剂量的高良姜素对肺癌H1299细胞生长情况的影响（IOOX）2.2 高良姜素对HI299细胞凋亡的影响流式细胞术检测结果（图3和表2）显示，与对照（0molL）组相比，6.25、12.5、25molL的高良姜素处理细胞凋亡率显著增加（P<0.05）,且随着剂量的增加，细胞凋亡率越多，其中在25molL高良姜素的促凋亡更为明显。0 mol>,L &2S moll.0 . M X / -I2.S >oLL| 25 molrL!ja«>g I MB>*I * ¾gMK3/7图3不同浓度高良姜素对H1299细胞凋亡的影响表2各组细胞凋亡率的比较Concentration(molL)Apoptosisrate(%,x±s)04.23+0.456.259.02÷1.01*12.518.48±2.33*2526.44±1.17*&F186.671P<0.05注：与OmolL相比，*P<0.05,与6.25molL相比，#P<0.05,与12.5molL相比，&P<0.052.3 高良姜素对H1299细胞Wnt3a、-catenin>BaX和Bcl2蛋白的影响与对照(0molL)组相比，6.25、12.5和25molL高良姜素处理肺癌H1299细胞后，Wnt3a、,catenin和BcL2蛋白表达水平显著降低，且具有剂量依赖性(P<0.05);与对照(0molL)组相比,6.25、12.5和25molL高良姜素处理肺癌H1299细胞后，Bax蛋白表达水平显著增加，且具有一定的剂量依赖性(P<0.05),见表3和图4。表3不同剂量高良姜素对Wnt3a、-catenin>BaX和Bcl-2的影响(%+S，n=5)Concentration(molL)Wnt3a-cateninBaxBcl-201.77+0.072.51+0.150.56±0.091.89±0.126.250.97÷0.11*0.99÷0.05*0.89±0.04+1.21±0.09*12.50.56÷0.070.88+0.11*1.21±0.1*0.88+0.10*#250.31÷0.04*m0.43±0.05*&1.79±0.21*&0.28±0.07*F23.37151.05337.12466.856P<0.05<0.05<0.05<0.05注：与0molL相比，*P<0.05,与6.25molL相比，#PVO.05,与12.5molL相比,&P<0.05O6.25I2J2SMlnOlIWnBa>catcninBaxBd2GAPDH图4不同剂量高良姜素对Wnt3a、-catenin.BaX和Bcl-2的影响3讨论在传统的中草药中，高良姜素在早期的中医药治疗活动中主要用于抗诱变和抗病毒作用。近年来研究发现，高良姜素在多种癌细胞中显示出抗癌特性，包括人类乳腺癌症、结肠癌、胶质母瘤、肝细胞癌细胞网、早幼粒细胞白血病和前列腺癌细胞”纥然而，高良姜素对肺癌细胞H1299研究少有报道，且对于高良姜素抗肺癌的作用机制尚不明确，本文将通过高良姜素对肺癌H1299细胞的增殖活性、细胞凋亡和WntZP-Catenin信号通路的影响。有研究发现，高良姜素对人食管癌细胞系Eca9706、ECl09的体外研究表明,高良姜素可以显著抑制细胞生长，诱导细胞凋亡并阻止细胞周期进展，从而发挥抑癌作用。GWakM研究发现，高良姜素能够抑制大肠癌和肝癌细胞系的增殖，其下调了-catenin的细胞内水平和P-Catenin/TCF依赖性基因的转录，如CyClinDI和C-Myc。本文研究结果发现，高良姜素可以显著抑制肺癌H1299细胞的增殖，且呈现一定的剂量依赖效应抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。贺文煜研究发现，高良姜素可以通过PI3KAKT信号通路抑制胃癌细胞增殖和诱导细胞凋亡，相关机制研究发现，其可能的作用机制与促进Bax的表达和抑制Bcl-2的表达有关。研究表明，在细胞凋亡的发生发展过程中，BaX和Bcl-2蛋白的异常是促进细胞凋亡的关键因素叫其中高表达的Bax可以促进细胞凋亡，而高表达的Bcl-2则对细胞凋亡的进程起到抑制作用，从生理功能分析，这两个蛋白的生物学功能是相反的。相关研究发现，Bcl-2蛋白主要位于线粒体膜外，Bcl-2主要通过抑制内质网膜上的Ca?+释放和抑制线粒体细胞色素C的释放，进而达到抑制细胞凋亡U4。而细胞膜外的BaX蛋白则可以促进细胞色素C的分泌增加，进而通过CaSPaSe信号通路的激活促进细胞凋亡。通过本研究结果发现，高良姜素作用于肺癌H1299细胞后，Bax蛋白表达水平显著增加，且具有剂量依赖效应，而Bcl-2蛋白表达水平则呈现显著下降的趋势，并具有一定的剂量依赖效应,这提示了高良姜素可以通过下调Bcl-2的表达和上调Bax的表达来诱发细胞凋亡。侯江雷研究发现，高良姜素可以抑制胶质母细胞瘤增殖和通过降低Bcl-2和升高Bax的蛋白表达水平诱导细胞凋亡，其可能的机制是通过抑制Wnt-catenin信号通过有关。Wm信号通路涉及许多生理过程，包括细胞增殖，胚胎发育和体内稳态。Wnt-catenin信号通路的异常激活与恶性肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭和转移密切相关。Wm3a是WnI家族的主要成员，可以激活经典Wntp-catenin信号通路，而-catenin是Wnt-catenin信号通路的关键蛋白。当Wnt-catenin信号通路激活时，Wm3a将信号传递到胞质蛋白，使-catenin由细胞质转移到细胞核内，从而参与调节细胞凋亡相关蛋白的表达口儿李永峰1研究发现，高良姜素可以通过降低Wnt-catenin信号转导通路相关蛋白从而抑制乳腺癌细胞增殖和促进其凋亡，从而发挥抗癌作用。本文研究中，高良姜素呈剂量依赖性地抑制Wnt3a和-catenin蛋白的表达，提示了高良姜素可以抑制Wnt-catenin信号通路，这可能与高良姜素诱导肺癌细胞凋亡的潜在机制之一。综上所述，高良姜素可以抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，其可能的机制是通过上调BaX蛋白和下调BCl-2、Wnt3a和-catenin蛋白表达，从而抗癌作用。参考文献1 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