第3章DNA结合蛋白.ppt

第一节 DNA结合蛋白第二节 RNA的转录第三节 启动子第四节 终止与抗终止第五节 原核生物和真核生物mRNA的特征比较第六节 内含子的剪接、编辑及化学修饰,第三章 生物信息的传递 从DNA到RNA,第三章 生物信息的传递 从DNA到RNA,第一节 DNA结合蛋白,200bp,DNA结合蛋白,基因,DNA结合蛋白的结合位点是一个基因的上游序列,一、研究DNA结合蛋白的方法凝胶阻滞实验(gel retardation)修饰保护测试(modification assay)修饰干扰实验（modification interference）二、DNA结合蛋白质的纯化 亲和层析法杂交探针法X-射线衍射晶体分析(X-ray diffraction pattern),标记DNA片段,标记DNA片段与蛋白质混合物,C1C2C3C4C5C6,C1C2C3C4C5C6,游离DNA,凝胶阻滞电泳,一、研究DNA结合蛋白的方法修饰保护测试(modification assay)原理：如果一个DNA分子携带一个结合蛋白，那么该部分核苷酸序列会被保护而不能被修饰。有两种修饰方法：1.用核酸酶处理，可以裂解除被结合蛋白保护之外的所有磷酸二酯键，通过足迹法进行检测。；2.暴露于甲基化试剂，例如可将甲基加到核苷酸G上形成二甲基硫酸盐，而被结合蛋白所保护的G则不能被甲基化。,DNase I 印迹试验(DNase I foot printing),修饰保护测试(modification assay),一、研究DNA结合蛋白的方法修饰干扰实验（modification interference）原理：如果一个对蛋白质结合起关键作用的核苷酸被改变，例如加一个甲基，则可能会抑制蛋白的结合。修饰剂二甲基硫酸盐（DMS）。修饰保护不应与修饰干扰相混淆，后者是蛋白质结合研究中的一种更敏感的技术。,用DMS处理靶DNA，使平均每条链上只有一个G被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合蛋白的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试验。分离各种DNA条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。如果因某个G残基的甲基化作用而阻止了蛋白质与DNA的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有蛋白质结合的DNA中观察到。,与蛋白质结合,与蛋白质结合,不能与蛋白质结合,与蛋白质结合的DNA带含有和两种类型的DNA片段,不能与蛋白质结合的DNA带含有全部3种类型的DNA片段,切出所有结合与不结合蛋白质的DNA带,并用六氢吡啶切割甲基化的G残基,缺失的DNA带表明相应G残基的重要意义,它得到结合蛋白质的保护,三、DNA和DNA结合蛋白的相互作用 不同的DNA结合蛋白有广泛的活性，而且调节基因组表达仅是这类蛋白的功能之一。多数参与基因组表达的蛋白质识别特定的DNA序列，并主要结合在这些靶位点上。尽管具有多样性，但所有的DNA结合蛋白至少都一个共同点，即它们与DNA结合，蛋白质与DNA的结合似乎只有有限的几种方式。,三、DNA和DNA结合蛋白的相互作用1.参与蛋白质相互作用的DNA核苷酸序列的直接读取,a：氢键受体d：氢键供体vdW：范德华力,B型双螺旋A-T碱基对的识别,核苷酸序列对螺旋结构的间接影响a.DNA双螺旋结构的多态性b.DNA弯曲（DNA bending）,三、DNA和DNA结合蛋白的相互作用,大沟宽,小沟窄,小沟窄,大沟不存在,小沟窄而深,大沟变深,小沟宽浅,A,B,Z,三、DNA和DNA结合蛋白的相互作用2.参与相互作用的蛋白质 为了以特异的方式结合，一个蛋白质必须以能识别核苷酸序列的方式与双螺旋接触。这个家族可以根据与DNA分子相互作用的蛋白质片段的结构而分为几个不同的群体。很多蛋白质中都有这些DNA结合基序（DNA-binding motif），这些蛋白常来自差别很大的生物，并且至少其中一些很可能进化了一次以上。与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用。,几种DNA结合基序,螺旋转角螺旋（helixturnhelix，HTH）基序,锌指(zinc finger),碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP),