第3章氨基酸.ppt
第1章 氨基酸(amino acid),1.1 氨基酸-蛋白质的构件分子,1.1.1 蛋白质的水解 蛋白质可以被酸、碱或蛋白酶催化水解。水解可分为完全水解和部分水解两种情况。,1.1.1.1 酸水解,一般用6mol/L HCl 或4 mol/L H2SO4回流20hr左右，蛋白质完全水解，不引起消旋，得到的是L-型氨基酸。但色氨酸完全被破坏，羟基氨基酸部分被分解，天冬酰胺和谷氨酰胺的酰胺基被水解下来。,1.1.1.2 碱水解,与5mol/L NaOH共煮10-20hr,完全水解，多数氨基酸不同程度的被破坏，得到的是L型和D型的混合物；精氨酸脱氨，但色氨酸稳定。,1.1.1.3 酶水解,不产生消旋，不破坏氨基酸。部分水解。胰蛋白酶（trypsin）、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin,糜蛋白酶)、胃蛋白酶(pepsin)。,1.1.2-氨基酸的一般结构,-氨基酸除R基为氢（甘氨酸）之外，其-碳原子是一个手性碳原子，因此都具有旋光性。并且蛋白质中发现的氨基酸都是L型的。,1.2 氨基酸的分类,1.2.1 常见的蛋白质氨基酸 按R基的化学结构20种常见氨基酸可分为3类：1.脂肪族氨基酸2.芳香族氨基酸3.杂环族氨基酸,1.脂肪组氨基酸,a 中性氨基酸,甘氨酸（氨基乙酸）是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。,b 含羟基或硫氨基酸,c 酸性氨基酸及其酰胺,d 碱性氨基酸,2 芳香族氨基酸,3 杂环族氨基酸,按R基的极性性质，20种常见氨基酸可分为以下4组：,非极性R基氨基酸丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸苯丙氨酸、色氨酸甲硫氨酸脯氨酸,不带电荷的极性R基氨基酸丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸天冬酰胺、谷氨酰胺半胱氨酸甘氨酸,带正电荷的R基氨基酸赖氨酸、精氨酸组氨酸（唯一一个R基的pKa值在7附近的氨基酸）,带负电荷的R基氨基酸天冬氨酸、谷氨酸,氨基酸的简写符号(一),氨基酸的简写符号（二）,1.2.2 不常见的蛋白质氨基酸,1.2.3 非蛋白质氨基酸 除了参与蛋白质组成的20-30种氨基酸外，还有150多种其他氨基酸。L型-氨基酸的衍生物，也有些是-、-或-氨基酸，或D型氨基酸。,1.3 氨基酸的酸碱化学1.3.1 氨基酸的兼性离子形式氨基酸晶体、水溶液 中性分子形式：,晶体熔点很高，200以上；使水的介电常数升高。,1.3.2 氨基酸的解离,20种基本氨基酸，除组氨酸外，在生理pH下都没有明显的缓冲作用，因为其pKa都不在pH7附近。组氨酸咪唑基的pKa值为6.0，在pH7附近，有明显的缓冲作用。,利用Handerson-Hasselalch公式，可算出在任一pH条件下一种氨基酸的各种离子的比例：质子受体pH=pKa+log-质子供体,几种氨基酸的解离常数和等电点,1.3.2 氨基酸的等电点（isoelectric point,pI）,对R侧链基不解离的氨基酸：pI=(pKa1+pKa2)对R侧链解离的氨基酸1.计算酸性氨基酸如天门冬氨酸。2.计算碱性氨基酸如精氨酸。,1.3.4 氨基酸的甲醛滴定 滴定是定量分析的常用方法，甲醛滴定法原理：,3.4 氨基酸的化学反应,3.4.1-氨基参加的反应3.4.1.1 与亚硝酸反应,这是Van Slyke法测定氨基酸的基础。,3.4.1.2 与酰化试剂反应,这些酰化试剂在多肽和蛋白质的人工合成中被用作氨基的保护试剂。,3.4.1.3 烃基化反应,2，4-二硝基氟苯与氨基酸生成二硝基苯基氨基酸。被英国的Sanger用来鉴定多肽蛋白质的N末端氨基酸。称Sanger 试剂。,与苯异硫氰酸酯（PITC，Edman试剂）反应，Edman用来鉴定多肽或蛋白质的N端氨基酸。,3.4.1.4 形成西佛碱反应3.4.1.5 脱氨基反应,3.4.2-羧基参加的反应3.4.2.1 成盐和成酯反应,3.4.2.2 成酰氯反应,这个反应可使氨基酸的羧基活化,3.4.2.3 脱羧基反应,3.4.3-氨基和-羧基共同参加的反应3.4.3.1 与茚三酮反应,3.4.4 侧链R基参加的反应其中有些反应是蛋白质化学修饰的基础。,Pauly反应，可用于检测酪氨酸。,半胱氨酸侧链上的巯基（-SH），反应性能很高，在微碱性pH下，-SH基发生解离形成硫醇阴离子（-CH2S-）。并可进一步与烷化剂反应生成稳定的烷基衍生物：,与乙撑亚胺反应,可用于序列测定(为胰蛋白酶提供了一个新位点)。也可用来保护肽链上的SH基，以防止被重新氧化为二硫基。,胱氨酸中的二硫键在稳定蛋白质的构象上起很大的作用。氧化剂和还原剂都可打开二硫键。如过甲酸和巯基化合物,3.5 氨基酸的光学活性和光谱性质,3.5.1氨基酸的光学活性和立体化学-氨基酸的-碳是一个不对称碳（手性碳），不对称碳原子上的4个取代基在空间的取向可以有两种构型，D型和L型。氨基酸的构型以D性甘油醛为参考物。,Thr、Leu、Pro和羟Pro还有第二个不对称碳原子。,3.5.2氨基酸的光谱性质3.5.2.1 紫外吸收光谱常见的20种氨基酸在可见光区域都没有光吸收，在红外和远紫外区（200nm）都有光吸收.,芳香族氨基酸因为其R基含有苯环共轭键系统，故在近紫外区（200-400nm）有光吸收的能力.蛋白质一般在280nm有最大光吸收，可用来测定蛋白质浓度。,分光光度法的原理是Lamber-Beer定律：A=log I0/I=-log T=cl T=I/I0 A：吸光值（absorbance）（光密度,optical density,OD）：摩尔吸收系数（摩尔消光系数）c：摩尔浓度 l：比色杯的内径或光程厚度 I0：入射光强 I：透射光强 T：透光率,3.6 氨基酸混合物的分析分离,要测定蛋白质的氨基酸组成或从蛋白质水解液中制取氨基酸，须对氨基酸进行分析分离。,3.6.1 分配层析法的一般原理层析 即色层分析也称色谱(chromatography)。层析的种类有很多种如吸附层析，离子交换层析等。分配层析依据的是分配定律。,分配定律(partition law)：当一种物质在两种给定的互不相容的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡时，溶质在两相中的浓度比值为一常数，即分配系数(Kd)。Kd=CA/CB某一物质在层析系统中的行为取决于有效分配系数 Keff=某一物质在A相中的总量/某一物质在B相中的总量溶质的有效分配系数可以调整两项的体积比而加以改变。,分配层析的原理（逆流分溶或逆流分配）：,3.6.2 分配柱层析,3.6.3 纸层析,3.6.4 薄层层析将支持剂（硅胶、纤维素粉等）涂布在玻璃板上制成均匀的薄层。分辨率高，所需样品极微，层析速度快。,3.6.5 离子交换层析,离子交换树脂是具有酸性或碱性基团的人工合成聚苯乙烯苯二乙烯(polystyrenedivinylbenzene)等不溶性高分子化合物。聚苯乙烯苯二乙烯是离子交换树脂的基质(matrix)。阳离子交换树脂，如SO3H（强酸型）或COOH（弱酸型），对于在酸性环境中的氨基酸阳离子，它们可以和H+发生交换而“结合”在树脂上。同样的阴离子交换树脂含有的碱性基团如N(CH3)3OH（强碱型）或）NH3OH（弱碱型）可解离出OH能与溶液里的阴离子交换而结合在树脂上。,分离氨基酸混合物经常使用强酸性离子交换树脂。氨基酸在树脂上的牢固程度，主要取决于他们之间的静电吸引，其次是氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用。在pH3左右，氨基酸与阳离子交换树脂之间的静电吸引力的大小次序是：碱性氨基酸（A2+）中性氨基酸(A+)酸性氨基酸（A-）。洗脱氨基酸的有效方法是逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度（离子强度）。,氨基酸自动分析仪,3.6.6 气液层析当层析系统的流动相为气体如氢，氦、氮，固定相为涂渍在固体颗粒表面的液体时，称为气液层析或气液色谱(gasliquid chromatography)，简称气相层析或气相色谱。待分析的样品被气化，气化了的样品将在流动的气相和固定的液体之间发生分配而被分离。被分开的组分和载气直接进入检测器。气相层析法具有微量快速的优点，限制是要求样品能气化和热稳定性高。,3.6.7 高效液相层析高效液相层析(high performance liquid chromatography，简称HPLC)曾称高压液相层析(high pressure liquid chromatography)。特点是：使用的固定相支持剂颗粒很细，因而表面积很大；溶剂系统采取高压，因此洗脱速度增大。多种类型的柱层析都可用HPLC来代替，例如分配层析、离子交换层析、吸附层析以及凝胶过滤。,作业（目的是复习，所以应认真自己做，并尽量做得全面仔细不应该应付）,1.什么是蛋白质的酸水解、碱水解和酶水解，各有何特点？2.写出20种基本氨基酸的结构、三字母缩写和单字母缩写。3.甘氨酸、组氨酸和脯氨酸各有何特点？4.什么是氨基酸的等电点？写出下例氨基酸的结构、解 离过程，并计算等电点：缬氨酸、谷氨酸和精氨酸。5.在多肽的人工合成中，氨基酸的氨基需要保护，有哪些反 应可以保护氨基？6.Sanger试剂、Edman试剂分别是什么？与氨基酸如何反 应，此反应有何意义？7.试写出半胱氨酸与乙撑亚胺的反应，此反应有何意义？8.写出氧化剂和还原剂打开胱氨酸二硫键的反应。9.蛋白质有紫外吸收的原因是什么，最大吸收峰是多少？10.什么是分配定律、分配系数？分配层析的原理是什么？11.什么是HPLC?12.书上P156,15题。,第3章检测题,1.写出下了列氨基酸的结构、解离过程，并计 算等电点：缬氨酸、谷氨酸和精氨酸。2.Sanger试剂、Edman试剂分别是什么？3.写出氧化剂和还原剂打开胱氨酸二硫键的 反应。4.什么是分配定律、分配系数？分配层析的原 理是什么？,2mmol/L 酸性缓冲液中含1mmol/L HA和1mmol/L A-,pH=pK=5(K=10-5),若向一升缓冲液中加入0.5mmol/L 量的H+(假定缓冲液的体积仍是一升)，(a)求A-和 HA的标准浓度和溶液的pH；(b)假设HA的增加（A的减少）刚好 等 于加入的H+的量，计算A和 HA的浓 度和溶液的pH.,解：（a）设加入H+后有y量的 H+被 A-结合成HA,则 HA A-+H+加H+前 10-3 10-3 10-5加H+后 10-3+y 10-3-y 10-5+0.510-3-yK=10-5=H+A-/HA=10-5+0.510-3-y 10-3-y/10-3+y,y1=10.3910-4=1.04mmol/L(舍去),y2=4.81510-4=0.4815mmol/L 代入“加H+后”，可求出 A-，HA pH=pK+lg A-/HA=4.545,（b）pH=pK+lg A-/HA=4.523,氨基酸章完,
