第4章吸附层析.ppt
第三章吸附层析,第一节概述,一、基本概念和色谱过程,1、概念色谱法(Chromatography），也称色层法或层析法。此种方法基于混合液中各组分的分子极性、分子大小与形状、吸附力、亲和力等物理化学性质的差异，导致各组分在流动相和固定相之间的分配系数不同，组分在两相间进行连续多次分配，从而彼此分离。色谱不只是分离技术，也是一种分析方法。,2、色谱过程,3、色谱方法的共同特点：色谱分离体系都有流动相和固定相两个相。色谱过程中，流动相对固定相作连续的相对 运动。被分离样品在两相中具有不同的作用力，各组分混合物在流动相的带动下通过固定相，实现分离。4、样品在分离时的两个基本点：混合物中不同组分在柱内的差速迁移同种组分在色谱体系迁移过程中分子分布离散,二、色谱法分类,1、按两相物理状态分类：用气体作流动相气相色谱用液体作流动相液相色谱固定相可以是液体或固体，便可组合成四种主要色谱类型：气固色谱（gas-solid chromatography,GSC）气液色谱（gas-liquid chromatography,GLC）液固色谱（liquid-solid chromatography,LSC)液液色谱（liquid-liquid chromatography,LLC,2、按固定相的形态分类,（1）柱层析(column chromatography)固定相装在柱内即为层析柱，根据层析柱的尺寸，结构和制备方法不同，分为填充柱层析和毛细管或开管柱层析。（2）平板层析(planar chromatography)固定相呈平板状，包括薄层层析、薄膜层析和纸层析。固定相以均匀薄层涂敷在玻璃板、塑料板或有机薄膜上，或将固定相直接制成薄板状，称为薄层层析(TLC)；用滤纸作为固定相或固定相载体的层析为纸层析(PC)。,3、按分离过程物理化学原理分类,（1）吸附层析(absorption chromatography)用固体吸附剂作层析的固定相，利用样品各组分在吸附剂上吸附力的大小不同，而将各组分分离。如气固吸附层析和液固吸附层析。（2）分配层析(partition chromatography)用液体作固定相，样品组分（溶质）在固定相中溶解、吸附或吸着能力不同，因而在两相之间分配系数不同将样品组分分离。如气液分配层析，液液分配层析。在液液分配层析中，根据流动相和固定相对极性不同，又分为正相层析和反相层析。,正相分配层析（NPC)一般以强极性、亲水性物质或溶液为固定相，非极性、弱极性或亲脂性溶剂为流动相，称正相层析。反相分配层析（RPC)以非极性、亲脂性物质或溶液为固定相，以极性、亲水性溶剂或水溶液为流动相，称反相层析。,（3）离子交换层析 ion-exchange chromatography（4）凝胶层析 gel chromatography（5）亲和层析 affinity chromatography,三、层析法的优点,生物大分子的特点：有多样性，以复杂的形式（混合物、复合物）存在，对环境如温度、pH 条件、离子强度的要求较高。用于研究的样品要求：一定的质和量，保存生物活性和严格的构象。层析法的优点1、在室温下操作2、流动相的pH 值可以与生理液相似选用含盐的缓冲溶液或与水互溶的有机溶剂,3、柱填料的表面经各种相应化学修饰和覆盖，为生物大分子的分离提供了温和的条件和“软接触”，利于保持其原有的构象和生理活性。4、样品量可多可少，可用于制备和分析。,第二节 吸附柱层析,一、常用术语1.固定相：层析基质2.流动相：洗脱剂、展层剂3.层析：样品在固定相和流动相中连续多次进行分配、吸附或交换作用，最终使各组分得到分离。4.操作容量：在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量。一般以每克基质结合某种成分的mmol数或mg数表示。,5.床体积：膨胀后基质在层析柱中所占有的体 积（Vt）。6.洗脱体积：某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现，浓度达到最大值时流动相的体积。7.膨胀度：单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积（V）。8.分配系数和迁移率,外水体积 Vo,洗脱体积 Ve,固定相,层析床,二、基本原理,生物大分子在层析柱中与吸附剂颗粒的表面吸附位点以范德华引力、静电引力进行可逆性结合,在洗脱剂（流动相）的作用下，通过吸附解吸附再吸附再解吸附的连续历程，依据各成份与吸附剂结合力之间的差异而达到分离。,影响吸附层析分离效果的因素,吸附剂的性质洗脱剂的性质层析柱及装填技术对样品的要求加样方式及加样量柱效,三、吸附剂的选择,选择性好对不同物质的吸附力差异性大表面积大增加吸附容量性质稳定不与被分离物、洗脱剂及溶剂发生化学反应；不分解不破坏被分离物；在一定范围的酸碱度、一定的操作压时不变形，不破碎。颗粒均匀、表面积大成本低廉,1、选择原则,2、常用吸附剂的特点羟基磷灰石：性质稳定、吸附容量大、适用范围广硅胶：化学惰性、吸附容量大、活性程度与其含水量关系密切（含水量高，活性小）极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。为便于解吸附，在分离极性大的物质时应选择极性小的吸附剂。,四、溶剂与洗脱剂,溶剂：溶解样品的溶液洗脱液：洗脱吸附柱的溶液选择时，从样品组分的溶解度、吸附剂的性质、溶剂的极性方面考虑。极性大的洗脱能力大，因此可先用极性小的作溶剂，使组分易被吸附，然后换用极性大的溶剂作洗脱剂，使组分易从吸附柱中洗出。,1、概念,2、选择洗脱剂的原则,性质稳定：不改变吸附剂的性质，如溶胀或收缩纯度高：防止流动相中的杂质在吸附柱上积累形成的污染能较完全洗脱下所分离的成分低粘度：高粘度时降低溶质扩散、增加柱压，降低效率样品容易回收无吸收背景：提高检测的灵敏度,五、层析柱及装填技术,1、层析柱吸附层析柱一般 d:h 1:101:402、吸附剂用量为分离样品的 30 50 倍3、柱子的装填干装与湿装,六、层析样品的要求,样品的溶解度好加入的样品量利于提高分辨率加样量 Vt Vt。样品的浓度与粘度的考虑,2,10,1,1,注意：加样时避免冲动基质,七、洗脱,1、原理溶解（解吸附），吸附，再溶解，再吸附，被吸附的物质解吸并随洗脱剂向前移动，又吸附到新的吸附剂上，再被洗脱剂解吸，如此反复，各组分吸附能力及溶解能力的差别导致移动距离的差异，使各种成份形成各自的区带，样品得以分离及纯化。若分离物是有色的，便看见色谱层。,2、流速与分离效果,流速太慢，前峰拖尾与后峰相连,流速太快，组分分不开,正常的流速使组分完全分离,装填层析柱柱的平衡加样洗脱收集测定绘制洗脱曲线合并有效成份计算含量（酶活力）基质的再生,八、操作程序,第二节薄层层析,一、原理：将吸附剂在玻璃或涤纶胶片片基上均匀涂布成薄膜或薄板，经过活化后，即可对样品进行展层，达到分离、纯化、制备、分析鉴定的目的。二、优点：1、展层时间短2、设备简单、操作方便3、干扰因素小4、显色方便5、灵敏度高,三、操作及注意事项,1、吸附剂的选择硅胶：略带酸性，适合于酸性和中性物质的分离。氧化铝：微碱性，适合于碱性和中性物质的分离。2、薄层板的制备（1）薄层的厚度与 Rf 值薄层厚度200M，Rf基本不变（2）薄层的活化 100oC,1h,硅胶薄层薄板的活性测定,苏丹黄、苏丹红、靛酚蓝在活化的薄层薄板上的层析行为,A B C D,（3）薄层的活性测定,3、样品的要求（1）样品的浓度1-5mg/ml（2）样品的纯度不含盐（3）样品与吸附剂的作用（4）样品的溶剂使用挥发性有机溶剂,4、展层剂的选择,（1）种类单一溶剂、混合溶剂（2）要求使样品组分很好地溶解与样品不发生化学反应将混合样品较好分离易挥发、粘度小、组成简单临时新配，只使用一次展层剂的极性在同一支持介质上，溶剂极性愈大，对同一化合物的洗脱能力也愈大，即在薄板上被推进得愈远，Rf值愈大。,不同展层剂对物质的分离影响,咖啡酸与绿原酸在极性不同的展层剂中的分离效果,特异性显色剂紫外光、荧光显色薄板中含荧光素腐蚀性显色剂,6、显色,5、展层装置与展层过程,（1）使用适当的装置,（2）装置的饱和度对展层的影响,6、操作程序,1、制备薄层板2、点样：点样斑点小，点样量适当3、展层4、显色,第三节 聚酰胺薄膜层析,一、基本原理聚酰胺是由己二酸与己二胺合成的、含有大量酰胺基团的化学聚合体。它与许多物质通过形成氢键的方式结合，氢键的强弱决定被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附力的大小。选择适当的展层剂使被分离物在聚酰胺薄膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，导致被分离物分离。,二、应用1、蛋白质 N 末端的 DNS 分析技术,DNS-蛋白质DNS-肽,荧光试剂（DNS-CL）+蛋白质（肽）,酸解,pH2-2.5,抽提,DNS-N 末端氨基酸,层 析,显 色,分析,丹磺酰氯与氨基酸反应生成荧光性质强和稳定的磺胺衍生物，也常用于多肽链的N末端氨基酸的鉴定。,2、蛋白质的氨基酸组成分析程序,蛋白质在盐酸中水解110，1824小时,中和,DNS-Cl,调pH9-10.5,盐酸调PH 23，乙酸乙酯抽提,DNS-氨基酸层析,
