第5章植物细胞制药一.ppt

第五章植物细胞工程制药,植物细胞培养与细胞工程,植物器官培养和快繁茎尖培养和无毒苗生产胚胎培养和胚挽救技术(包括胚乳培养、试管受精)花药培养和单倍体育种细胞培养和次生代谢产物的工业化生产植物突变体筛选利用和体细胞无性系变异原生质体培养和融合人工种子,细胞工程,理论基础,细胞的全能性,植物细胞工程制药第一节 序言,从植物中寻找高效、低毒、廉价的药物，以期攻克许多危害人类的疾病、癌症、艾滋病等。高等植物的次生代谢产物丰富多样，在食品、医药、化工、农业中做为原料得到广泛的应用。人工合成单一的植物次生代谢产物十分困难：收率低、成本高、合成工艺复杂、合成后的异构体拆分困难。植物细胞培养是获得植物次生代谢产物的捷径，但技术仍有待完善。,有些极其昂贵的生物药物，如抗癌首选药物-紫杉醇等，可以用大规模培养植物细胞来直接生产。近年国内在红豆杉组织培养中获得生长量高达0.49gFWd-1的细胞系，每升细胞培养物中紫杉醇的产量可达0.25mg。,基本概念,植物细胞的全能性：植物体中任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个性。,植物的分化（differentiation）可以分为胚胎发生和器官发生两个阶段。前者是从精子与卵细胞结合开始，分化为幼胚进而发育为成熟胚和种子；后者是种子在适宜的条件下萌发，形成根、茎、叶、花和果实。脱分化（dedifferentiation)：已经分化的细胞、组织和器官在人工培养的条件下又变成未分化的细胞组织的过程。再分化（redifferentiation)：通过脱分化诱导形成的愈伤组织在适宜的培养条件下可再分化成为胚状体或直接分化出器官。由体细胞或性细胞通过脱分化形成胚状体；这愈伤组织直接形成胚状体。上述两种途径都可进一步发育成同母体相同的植株，即植物细胞全能性。,外植体（explant）：是指用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切段），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药和花等均可作为外植体进行组织培养。无性繁殖系（clone）又叫克隆，在植物细胞工程中是指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同一外植体而获得越来越多的无性繁殖后代。同一无性系分离出来的两个或多个不同的系列，称为无性系的变异体。,植物细胞工程,过程,外植体,脱分化,植物激素：细胞分裂素、生长素,再分化,次级代谢作用和次级代谢产物,初级代谢产物：维持细胞生长必需的代谢产物，它包括合成代谢的中间产物及终产物。次级代谢产物：由初级代谢产物衍生而来，对生物的生存、生长、繁殖无关的那类代谢产物。,植物细胞与组织培养,植物细胞的结构特征,基本特征：有刚性的细胞壁和大的液泡，以及质体（如叶绿体）。主要生理活性特质：酶类、维生素、植物激素、抗生素和植物杀菌素、生物碱、糖甘类、挥发油、有机酸等。植物培养细胞的生理特性,第四节 植物细胞培养基本技术一、植物材料的准备,1、外植体(explant)的选择,用于直接分离细胞的外植体的选择,叶片是直接分离单细胞的最好材料。选择适当生长期健康植株，并选择细胞之间粘连程度比较小的组织。但从外植体直接分离细胞由于受到酶或机械的作用，细胞结构会受到一定程度的损伤，获得完整细胞的数量较少，使用受到限制。,取自活体植物体、接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。,第四节 植物细胞培养基本技术一、植物材料的准备,1、外植体(explant)的选择,用于愈伤组织诱导的外植体的选择,不同植物种类对于诱导条件的反应不同；同一植物不同部位的诱导难易程度不同；基因型对愈伤组织诱导的影响；外植体生理状态直接影响诱导；取材季节也是成功的重要条件之一；选用产生欲生产的次生代谢产物的组织器官。,第四节 植物细胞培养基本技术一、植物材料的准备,1、外植体(explant)的选择,用于分离原生质体的外植体的选择,苗龄和叶龄对于原生质体的产率影响最重要；苗龄对用子叶或下胚轴诱导原生质体培养影响明显；使用叶片做外植体时，叶片中部原生质体得率最高；,第四节 植物细胞培养基本技术一、植物材料的准备,2、外植体的预处理,外植体的灭菌消毒处理,茎尖、茎段及叶片的处理：,自来水充分冲洗，用粘肥皂粉或洗洁精的软毛刷刷洗，吸干水分；75酒精浸泡10-30秒钟，无菌水冲洗 2-3次；2-10次氯酸钠中10-15 min，或0.1-0.2%升汞浸泡5-10 min；如果材料表面不平或有茸毛，可在消毒液中加几滴Triton X或Tween-80以强化灭菌效果；材料灭菌后立即取出，用无菌水冲洗4-5遍，用无菌滤纸擦干；,第四节 植物细胞培养基本技术一、植物材料的准备,2、外植体的预处理,外植体的灭菌消毒处理,果实及种子的消毒处理：,自来水冲洗，用75酒精迅速漂洗一次；果实：用2次氯酸钠浸泡10 min，无菌水冲洗几次；种子：10次氯酸钠浸泡20-30 min，甚至几小时；还可用0.1%升汞再处理 5 min；对于做胚或胚乳培养的种子，可先去掉种皮，4%-8%次氯酸钠浸泡8-10 min，用无菌水冲洗多次。,第四节 植物细胞培养基本技术一、植物材料的准备,2、外植体的预处理,外植体的灭菌消毒处理,根及地下贮藏器官的消毒处理：,用自来水冲洗干净，用软毛刷刷洗；用滤纸吸干后用纯酒精漂洗；0.1%-0.2%升汞浸泡5-10 min，或2%次氯酸钠浸泡10-15 min；无菌水洗3-4次。,第四节 植物细胞培养基本技术一、植物材料的准备,2、外植体的预处理,外植体的灭菌消毒处理,花药的消毒处理：,发育适宜时期的花药被严密地包裹在花萼、花瓣或颖片之中，属自然无菌状态；花蕾用70酒精擦拭；将花蕾浸泡在饱和漂白粉的上请液中10 min；无菌水冲洗 2-3 次；小麦、水稻、玉米等的幼穗去掉外层苞片，70简单消毒后即可接种。,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,碳源：以蔗糖为主，具有叶绿体的细胞可以利用CO2；氮源：硝态氮对植物细胞生长有利；无机盐：在各种培养基中的大量元素和微量元素，以磷酸盐、硫酸盐和硝酸盐的形式提供；生长因素：氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素、生长激素,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,来源：不含或少含某些离子的重蒸水（双蒸水）或去离子水。目的：保持培养基成分完全人为控制。作用：起媒介作用 组成作物体（占7580%）提供O、H元素 运输物质、调节渗透压,1、水：培养基大部分是水,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,大量元素：每升培养基含 0.5 mM以上微量元素：每升培养基含 0.5 mM以下大量元素：O、H、N、C、P、K、Mg、S、Ca,2、无机盐、大量元素、微量元素,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,来源：硝态或氨态氮，或两者混用。作用：N吸收转化氨基酸蛋白质 蛋白质主要组分是N；核酸含N；酶本身是蛋白质；细胞生长分化需N；,2、无机盐、大量元素、微量元素,N,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,2、无机盐、大量元素、微量元素,来源：NaH2PO4 或 KH2PO4作用：是植物体必需元素之一；与蛋白质合成有关，缺磷蛋白质含量降；高能磷酸键的化合物，供能ATP；形成核蛋白、含P化合物、核酸组分；碳水化合物、蛋白质、脂肪合成、相互转化需磷。,P,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,2、无机盐、大量元素、微量元素,Mg、S,来源：MgSO4.7H2O满足硫镁的需要。作用：镁是叶绿素组分；S是蛋白质、氨基酸、酶的组分，缺S影响蛋白质合成、影响叶绿素形成。,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,2、无机盐、大量元素、微量元素,K、Ca,K：来源：KCl、KNO3、KH2PO4 作用：酶促反应活化剂。Ca：来源：CaCl2.H2O 或 Ca(NO3)2.4H2O、作用：影响酶的活性方向。决定新陈代谢的过程。构造细胞壁，影响细胞分裂。,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,2、无机盐、大量元素、微量元素,Fe、Cu、Na,Fe：来源：Na2EDTA螯合剂加FeSO4.7H2O和乙二胺四乙酸二钠（EDTA）螯合铁，pH 7.6-8.0。作用：植物组织延长生长有作用。Cu：促离体根生长。Na：酶的组成成分，防叶绿素破坏。,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,Mn：与植物呼吸作用、光合作用有关。B：影响蛋白质合成。,注意:不同培养基无机盐浓度相差有的高达10倍；高浓度无机盐保证组织生长需要的矿质营养，使生长加快；根要求无机盐浓度低些。,2、无机盐、大量元素、微量元素,Mn、B,无机盐的影响,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,碳源来源：蔗糖、萄葡糖、果糖、麦芽糖、纤维二糖或多糖类的可溶性淀粉、糊精及果胶；一般为 23%的蔗糖。作用：维持培养基的合适渗透压；构造植物体；参与新陈代谢。注意：不同浓度影响细胞的增殖分化。,3、有机化合物 碳源、维生素、氨基酸、植物激素,蔗糖的影响 1,蔗糖的影响 2,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,3、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素,维生素类：V-C（抗坏血酸）：强还原能力，防组织氧化变褐。V-B1（硫胺素）：促愈伤组织产生，与愈伤组织活力有关。V-B2（烟酸或维生素PP）：促代谢，促胚的发育，高浓度会抑制生长。V-B6（吡哆醇）：促根生长。肌醇（环己六醇）：无促进生长的作用，但有助活性物质发挥作用。,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,氨基酸来源：常用甘氨酸及多种氨基的混合水解酪蛋白，水解乳蛋白等。作用：是蛋白质的组分；促进器官增殖；可作有机氮源。,3、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,3、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素,植物激素：生长素 吲哚乙酸（IAA）：特性：天然生长素 作用：促离体组织生长、促进愈伤组织形成。萘乙酸（NAA）：特性：人工合成的化学物质。作用：利发根，但根较细弱，IAA+IBA(吲哚丁酸)处理使根生长健壮。2,4-D（二氯苯氧乙酸）：作用：促愈伤组织形成，诱导作用比IAA高10倍。抑制器官、绿芽、根形成，特别是高浓度时抑制作用更强。,激素的影响 NAA,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,3、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素,植物激素：细胞分裂素 6-呋喃甲基腺嘌呤(激动素、KT)：化学合成物质。作用：广泛诱导芽的形成，诱导愈伤组织时，适量加 KT 能改善器官发生状况。6-苄基氨基嘌呤(6-BA)：人工合成 作用：广泛诱导芽的形成，BA效力比 KT大。玉米素(ZT)：天然产物 作用：对某些植物有特效。腺嘌呤(AD)：作用：诱导植物细胞分裂，对芽形成有促进作用。,激素的影响 BAP,植物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和分裂素的比例。高浓度生长素和低浓度分裂素刺激细胞分裂；而低浓度生长素和高浓度分裂素则刺激细胞生长。极个别植物组织含有合成足够和量内源植物激素的能力；绝大多数植物组织和细胞培养基加入一定量的植物生长调节剂。少数培养物在经历了多次继代培养后也可能自发成长为激素自养型（不稳定表型），此类组织的优点是其生长率高和费用低。,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,3、有机化合物 碳、维生素、氨基酸、植物激素,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,来源：从红藻等海藻中提取的高分子化合物。特性：90熔解，40以下凝固；过酸、过碱或加高温会发生水解丧失凝固力，存放过久会变褐丧失凝固力。用量：琼脂 0.6-1.0%，卡拉胶 0.4-0.8%。作用：凝固剂，固体培养时使液体培养基凝固。,4、琼脂,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,培养基母液的配制,1、大量元素10倍母液：分别称取10倍量的硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙，分别溶解，按上述顺序混合，定容至1000 ml；配制1000 ml培养基取100 ml。,2、微量元素100倍母液：分别称取1000倍量的硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、硫酸铜、氯化钴、钼酸钠，分别溶解，按上述顺序混合，定容至100 ml；配制1000 ml培养基取 1 ml。,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,3、铁盐100倍母液 分别称取100倍的FeSO3和Na2EDTA，分别溶解，然后混合，定容至100 ml，配制1000 ml培养基取10 ml。,4、维生素与氨基酸母液,培养基母液的配制,每种单独配制成1mg/ml的100 ml母液；氨基酸用量一般较高，可直接称取加入培养基；肌醇、酵母提取物、酪蛋白水解物等用量大，也无需配制母液，直接称取加入培养基即可。,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,培养基母液的配制,5、植物激素母液单独称量，单独配制成0.12.0 mg/ml的母液；生长素类先用少量0.1 M NaOH溶解，细胞分裂素需用1 M HCl少许先行溶解，再稀释到所需浓度；赤霉素(GA3)在水中不稳定，需用95酒精配制母液；脱落酸(ABA)需先少量丙酮助溶，然后加水溶解；一般生长素浓度的使用为0.05-5mgL，细胞分裂素0.0510mgL。,第四节 植物细胞培养基本技术二、培养基,激素的配比模式,无激素的培养基被称为基本培养基。植物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和细胞分裂素的比例：形成愈伤组织、长根还是长芽。,第四节 植物细胞培养基本技术三、培养方法,植物细胞/组织培养方法很多，其分类也不尽相同。,1.固体培养包括利用琼脂作为支技物的固体培养和固定化细胞培养。特点：简便易行、培养所占空间小缺点：培养条件不均一，易堆积有害代谢物，难以控制和检测常用固化剂：琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、聚丙烯酰胺、淀粉和硅胶等。,第四节 植物细胞培养基本技术三、培养方法,第四节 植物细胞培养基本技术三、培养方法,固体培养：用琼脂(0.6%-1.0%)、明胶(10%)等做支持 物的固体培养因简便易行而被普遍使用。液体培养：无凝固剂支持物的悬浮培养。控温：251控光：有些植物材料在诱导愈伤组织阶段需要避光，但生长、分化和再生都需光。用日光灯供光，16 h/d。外植体在培养3周左右必须更换到新鲜培养基中(继代培养)。,2.液体培养一种外植体经过一定次数的继代培养，待愈伤组织变得较为疏松时，其培养物就可用于悬浮培养。液体培养系统包括小规模的悬浮培养和大规模的成批培养、半连续和连续培养。悬浮培养可分为静止和振荡两类。静止培养简便易行，而且不会出现营养物质浓度差的现象。振荡液体培养，是使悬浮细胞在液体培养基中，利用磁力搅拌或摇床在不断振（摇）动的情况下进行培养，此法可克服静止培养的许多缺点。,第四节 植物细胞培养基本技术三、培养方法,1.成批培养法将培养基一次性加入反应器中，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式称为成批培养法。最适于植物细胞培养的生物反应器当属气升式反应器，它用通气代替搅拌，避免了使用机械搅拌所致的细胞破碎、通气受限制、培养物易污染等缺点。植物细胞两步培养法：第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。（实例：紫草宁）,第四节 植物细胞培养基本技术 三、培养方法植物细胞大规模培养系统,2.半连续培养法在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培养法。通过调整收获细胞的数量和次数来保持细胞重量的恒定。实例：烟草细胞培养,第四节 植物细胞培养基本技术 三、培养方法植物细胞大规模培养系统,植物细胞悬浮培养反应器（搅拌式）,3.连续培养法利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。=max S/（Ks+S）连续培养法培养时间长，其细胞的生产能力比较高，但技术条件要求较为苛刻。在培养特定细胞或生产次级代谢产物时，又应用了二阶段连续培养法第一罐投入生长培养基进行连续培养，第二罐投入生产培养基进行连续培养，两罐间连通管道连接。实例：生物烟草细胞,第四节 植物细胞培养基本技术 三、培养方法植物细胞大规模培养系统,4.固定化培养法植物细胞固定化培养技术，可使细胞块中各个细胞处于一定理化梯度下，与完整植株类似，是目前相对优化的培养方法。固定化反应器：网状多孔板、尼龙网套、中孔纤维膜等。突出优点是细胞位置固定，易于获得高密度细胞群体及维持细胞间物理化学梯度，利于细胞组织化，易于控制培养条件及获得较高含量的次级代谢产物。实例：辣椒细胞固定化培养生产辣椒素。,第四节 植物细胞培养基本技术 三、培养方法植物细胞大规模培养系统,