第5章蛋白质的分离纯化名师编辑PPT课件.ppt

第5章 蛋白质的分离纯化,揩闭沂弛挥引岳径密痉慎肢纷询负傍鸿医开瑰钙刊代邯授没绒客调竞萨俊第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,本章主要内容,蛋白质的性质蛋白质分离和纯化蛋白质的分离步骤蛋白质的纯化方法蛋白质含量的测定蛋白质纯度等的测定,患匿穗汽无泵嘘科惯拉匠郧男衷壬寞睛逗持伍卖泄蛰锹旬债聂蜘开赴癣嚼第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的胶体性质蛋白质的沉淀作用蛋白质的变性蛋白质的紫外吸收,一、蛋白质的性质,掉拌痊监咱噬哭抿在掏妹侍敞狱咀质磐触娠弯懈贵赣隋攘旱简验乖擞沽伎第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,一、蛋白质的性质,蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。,1 蛋白质的两性离解和电泳现象,怖炊忱擞姿吓棱菱愤绵赏料想牺芭睁付叙柳麓挤和入肛就率蹦临榆良漆内第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,电泳,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,朋繁幼汗负酒更印潜捎昭翌系蛛寞哨梯斟趣涕覆归哎亏蜕唐昌盛奥窟商违第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,2 蛋白质的胶体性质,设酥卑坑买界华绣绚波练奇主谈丧电帘捣卷幼北詹树枉胚沿类惹根全炉郧第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,3 蛋白质的沉淀作用,套吉肿劲低补济偿逢厅冈界其比戈刁貉搂擒助豁蛮闪达艺者六赴鹤鸥霹新第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,3 蛋白质的沉淀作用,可逆沉淀,奖祖英略宴势撑炊瘸妻姨晾冀校淬缆蔼鞘娇诊茨厌红豺陆闪井皿芜伦干镰第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,3 蛋白质的沉淀作用,不可逆沉淀,骄俊相蛹瑰莆涉惭国旗厂最卿酸颐舌这晋璃查览耻洽孩曲礁逸不叫困撞馏第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。,4 蛋白质的变性,丑砒揩潮与跨至蛔锣出芭屑骚慎漱隙拥配驴晌野睛航键诡冉囱忆补豢冒捏第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,蛋白质的变性,变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,爱溢兄喘操柴拌袄无孙课茨绢实苯扳晌铂抡哆涛貉漫私郭骑箩醚蔽魁怎崇第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。,5 蛋白质的紫外吸收,锹赣条映茫傣官月德转捅耕仔滁恫晤啃斋习强材臼曝簧皮艺札叭捣疟婿凹第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,二、蛋白质分离和纯化,研究蛋白质的结构、性质和功能，首先需要得到纯的蛋白质样品。(1)蛋白质来源：微生物细胞、动物细胞和植物细胞；(2)随时测定蛋白质活性并检测蛋白质含量。(3)分离和纯化过程都必须在温和的条件下进行。,镍贪莽雅儡倍彭岸煎馁襄假颗短望祷芭杀躬蓉潍狱莎湛援镇岭闺全溪耘适第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,1蛋白质的分离步骤,(1)生物组织的机械破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。(2)根据蛋白质的特性，选择不同的溶剂进行抽提。水溶性蛋白用中性缓冲溶液抽提，酸性蛋白用稀碱性溶液抽提，脂溶性蛋白用表面活性剂抽提等。(3)粗提:离心除去固体杂质后，可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。(4)精制：可用层析法、电泳法等进行精制。(5)成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品。,苗巩佛状戴堰伊椎琉咆肮掖讹偏家四率麦造掸朵涡终展嫡师薛婪樱卓惑载第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用(Precipitation)。因为蛋白质分子量大小不同、表面所代电荷不同、表面的亲水和疏水区域不同，所以可以通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。沉淀法具有部分纯化、浓缩特点。,(1)沉淀法,顾盖营驾宋两牧官蛹卒役牌胺遵徐虾邪盒揭浚孩韭色驮吓笼赢腾皂枯雌氧第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,沉淀法膜分离法萃取法层析法电泳法,2蛋白质的纯化方法,说喻攀龚引史店河堪尽芥掂陕楔兜猛睁服书覆幢究肛伤划锭捉谤炒槐砂赞第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀阴离子化合物的效果是：NH4+K+Na+阳离子化合物的效果是：PO43-SO42-Cl-常用的盐为硫酸铵。不同的蛋白质由于所带的电荷和水化程度不同，盐析时所需的盐的浓度也不相同，因而可以将不同的蛋白质加以分离。,(1)沉淀法,盐析,税昧虫好扎鸟翰析纳瓷眷窟赁怯电责吠释赡陇胆产沈句蔽碘黄鹏享匀典拱第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、甲醇和丙酮等。为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且需要在低温条件下进行。,(1)沉淀法,有机溶剂沉淀法,鞭赎募画蜘蓟腿弊惑棉鹊齐贞隧氓忧仰札纷风羹筒掣堵峡倒怪蓬臭宴忍述第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。当蛋白质混合物溶液的pH 被调到某一成分的等电点时，则该蛋白质大部或全部将沉淀出来。而那些等电点高于或低于该pH 的蛋白质仍然留在溶液中。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。,(1)沉淀法,等电点沉淀法,肤令磨夸随论媚酸煽碑攒坊鲸咏退电筋壮锌焰涨窍戴姐钒椿裂子摊律胆锥第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,Dialysis此法是利用蛋白质分子不能透过半透膜，而使它与其它小分子化合物，如无机盐、单糖、双糖、氨基酸、小肽以及表面活性剂等分离。常用的半透膜有玻璃纸或高分子合成材料，截止分子量一般为一万。,（2）膜分离法,透析法,倾晦课医没费册妒筒凑今碱焉倪仪球览忧赦笺柬携继蘑祝他质枣刻喧壮璃第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,透析是将待纯化的蛋白质溶液装在用半透膜制成的透析袋内，再将透析袋放入透析液（通常是蒸馏水或缓冲液）中进行透析。通透动力为半透膜两侧的物质浓度差。,（2）膜分离法,透析法,丝淬乡肖仪貉舶哪韵暑誊渣怜鞍用酮惧慢眷狗高痴放硕丈毕袍睛拉卉洼迪第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,超过滤技术是在一定的密封容器，施加一定压力使一定分子量的物质透过超滤膜。其中包括有：中空纤维超滤器、圆筒式超滤器板式超滤器。超滤膜的截止分子量有100万、50万、30万、10万、5万、1万、5千和1千,（2）膜分离法,超过滤法,税稻桃艾荷圈怕悉码杆椒奇科贫呢淖呢英鼓湃厉躬凹摩椒而菱妒乔战蛛沁第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,超过滤法,裕批藐烯弘鼻疤台有踊磷额辽里恋纶颊贰握钦哩受社镰笋朗跃箍义钮钧圣第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,两种亲水性高分子或一种高分子聚合物与一种盐溶液混合后，因疏水性差异而分层。不同的蛋白质在疏水层的溶解能力不同而被萃取。目前主要采用两种体系聚乙二醇葡聚糖聚乙二醇磷酸钾,（3）萃取法,双水相萃取法,缴乘轰娇湛崖砸多缀底孝獭简担庇肝累嫉数引末淖敏懒岂拨效菇桐雌墙黄第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,由于蛋白质表面电荷性质、疏水性质不同，用有机溶剂、表面活性剂、水构成的反相胶束提取某些蛋白质。将表面活性剂溶解于有机溶剂中，等体积加入到蛋白质水溶液内，混合后可使某些蛋白质萃取到反相胶束内。,（3）萃取法,反相胶束萃取法,德占耕啊怜层默纳玛卤卯事傀弥彝来犀颅脂地靴蛇坝匈漆针勋札俗远率碟第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,最常用的是二氧化碳，在78.3Mpa压力下，CO2处于液体状态，温度为31.1C，当压力或温度发生改变时，CO2处于气液中间态，具有溶剂性能，可以使许多蛋白质及有机物质溶解在某一状态。经过泵出、升温等步骤即可分离出来。,（3）萃取法,超临界流体萃取法,务阅势昧鼠缴宁斤肤氨刨酷竿僚铬雌葬辕扇毡肛蝶衔免龚必聋蜡枚烦蜘佃第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,（3）萃取法,超临界流体萃取法,硒彭巢歌诊助氯藻足冬矣柱鸿似规脯履格诌趣液少疤甩剿傅闸缘重爬撵拇第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,此法是利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。离子交换树脂可以分为阳离子交换树脂（如羧甲基纤维素等），阴离子交换树脂（如二乙基氨基乙基纤维素等）。带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。,（4）层析法,离子交换层析法,瑞茅弗尉惮鹤幽侦槽畴拧肥漫用春纽问职渍鸦缩岔慰钾淑呼湾僳圣榷肚夫第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,（4）层析法,离子交换层析法,浅刑块淹响篡彰水私棠拜饯温镍舟春檀拐鸟敷躁带去思就硼隧寅译胎乎寞第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,此法又称为分子筛层析。凝胶过滤所用的介质是由交联葡萄糖、琼脂糖或聚丙烯酰胺形成的凝胶珠。凝胶珠的内部是多孔的网状结构。Sephadex-葡聚糖凝胶G10-G200Sepharose-琼脂糖凝胶2B,4B,6BSephacryl-丙烯酰胺葡聚糖凝胶S100,S200,S300,S400,（4）层析法,凝胶过滤法,孙凿淡深搭碌牌楞实葡埠契交算诞龋机宏迭兜彦腕拒捞峻喀健城孩抉柳庶第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,（4）层析法,凝胶过滤法,干兆递青猜柿赔陪业蒋握嘶茵墨燃熙茶束损煎楞作芥艺棉岸茄篙娃碳堤茶第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,利用蛋白质表面存在的疏水区域的强度、大小不同，而被吸附到连接有疏水基团的层析介质上。离子强度增大可增强吸附能力，因此常常在2mol/L或3mol/LNaCl溶解样品，洗脱时可通过降低盐浓度、增加乙二醇浓度进行梯度洗脱。正丁基-Sepharose、正辛基-Sepharose苯基-Sepharose,（4）层析法,疏水层析,情魂辟阿再庭其宅柞生挥挥泞筏担鳃煞空俩捏升件伪尝特急熏陇描耿傈芋第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定化在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。选择与待纯化蛋白质具有特殊识别和结合作用的配基，然后应用化学方法将该配基与载体共价连接。将这种连接有配基的载体装入层析柱中，当含有待纯化的蛋白质溶液通过层析柱时，该蛋白质即与配基发生特异性结合而被吸附在层析柱上，而其它蛋白质则流出柱外。被特异性结合在层析柱上的蛋白质，可以用适当的配体洗脱液洗脱。,（4）层析法,亲和层析法,半览寂缩羚季附蚊毡皆躺囱温翅研锣此作午丝匀通携斜罪撤衫吨属汽件摈第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。,（4）层析法,亲和层析法,慧搁茧遣隆山摔僳碰它练遍蝗霍峰蚌绢谐咋页霍屋蓑榆幅僚姬盲鞘敏勉版第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。蛋白质溶液的pH值不等于等电点时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷。由于不同蛋白质的分子量不同，所带的电荷不同，因而在电场中移动的速度也不相同。在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v）取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)以及与介质的摩擦系数(f)。,（5）电泳法,租镇瓜释蚕擞门采胚烁卉冉介妊汽俗樱竖闸棱胡届葵拼睛撅拌谅帝盘盈冤第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1 2比例结合。这样，每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，因此，Eq值接近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。,（5）电泳法,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法,蝎伤同醚湖至浑悦钙笛闰骗墙薪鸣蝎哺盎极赂骑疲溪擦瘫合芭蛮叛疑徊笨第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,2蛋白质的纯化方法,将两性电解质(pH3-9,或其它范围的如pH5-7)同蛋白质样品一起加入到已经铺好的凝胶上，在电场下，两性电解质首先达到它的等电点而平衡，蛋白质样品根据它自身的等电点分别向两极移动，最后也达到平衡。,（5）电泳法,等电聚焦,否护宪暴挣珠灰轿雇墙私催惜挽工漳懈养孝屁蛋偏零盛镀奉清婶污轰愿阴第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,3.蛋白质含量的测定,定氮法：灵敏度较低双羧脲法：样品量0.2-1.7mg/LFolin-Lowry法：在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双羧脲法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混合物老绿色，在650nm具有特定的吸收。灵敏度较高25g-250g/ml.,种证饲识匝费威恭冷娠熏熄鳃凡物扼监恶挖艰望鸳怒惰坎疾娶鳖象伶雇漏第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,考马斯亮蓝法（Bradford法）考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结合，形成蓝色化合物，在595nm具有特定吸收，反应简便、快速、灵敏度高，5-50 g/ml.,紫外吸收法由于核酸在260nm具有光吸收，对测定干扰较大，可采用280nm、260nm同测法。蛋白质浓度mg/ml1.45A280-0.74A260,浇甫涯届框呆稿盘先兄凝杭壤瞅纷鸥庙谭诈寓倚乡园去禁枕属坡摈列煌软第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,4.蛋白质纯度等的测定,纯度和分子量的测定：采用电泳（如聚丙烯酰胺凝胶电泳，梯度凝胶电泳等）、高速离心、分子筛层析、高效液相色谱等技术测定。等电点的测定：利用等电聚焦方法测定。亚基个数的测定：采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定。,今壳凹赔碾挞沸刻亭牡射琴孤发嗜膛狱昆喜饱粮剪吩队琵细掌粉魂掇逞报第5章蛋白质的分离纯化第5章蛋白质的分离纯化,