第8章氧化还原酶.ppt
2023/11/7,1,第8章 氧化还原酶,主要内容：一、过氧化物酶二、多酚氧化酶三、脂肪氧合酶四、葡萄糖氧化酶五、超氧化物歧化酶,2023/11/7,2,一、过氧化物酶（PODperoxidase）,过氧化物酶是存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应。,2023/11/7,3,1过氧化物酶作用方式及分布,1.1过氧化物酶作用方式 过氧化物酶（供体：过氧化氢 氧化还原酶）催化过氧化氢分解时，同时有氢供体参加。H2O2+AH22H2O+A,酚类、胺类化合物、某些杂环化合物和一些无机离子等都可以作为过氧化物酶的供氢体。,2023/11/7,4,1.2过氧化物酶分类（1）含铁过氧化物酶正铁血红素过氧化物酶：含有正铁血红素为辅基，存在于高等植物、动物和微生物中。绿过氧化物酶：绿过氧化物酶的辅基也含有一个铁原卟啉基团，这类酶存在于动物器官和乳中（乳过氧化氢酶）。（2）黄蛋白过氧化物酶：含有黄素腺嘌呤二核苷酸作为辅基，这类酶存在于微生物和动物组织中。,2023/11/7,5,1.分布：过氧化物酶在植物细胞中以两种形式存在：以可溶形式存在于细胞浆中以结合形式在细胞中与细胞壁或细胞器相结合,2023/11/7,6,2 过氧化物酶在食品加工中的应用,（1）过氧化物酶是果蔬成熟和衰老的指标：如苹果气调贮藏中，过氧化物酶出现两个峰值，一个在呼吸转折（成熟），一个在衰老开始。（2）过氧化物酶的活力与果蔬产品，特别是非酸性蔬菜在保藏期间形成的不良风味有关。（3）过氧化物酶属于最耐热的酶类，在果蔬加工中常被当作热处理是否充分的指标。,2023/11/7,7,方法：将已热处理的原料中抽取样品，横切，随即放入愈创木酚或联苯胺溶液中，然后取出，在切面上滴0.3%H2O2，数分钟后，用愈创木酚处理的样品变为褐色，联苯胺变为深蓝色，说明过氧化物酶未被破坏，热处理时间不够，如果均不变色，则表示热处理效果良好。,POD的测定方法：,2023/11/7,8,3过氧化物酶最适pH和最适温度,3.1最适pH过氧化物酶一般都含有多种同功酶，因此最适pH范围较宽。酸性状态，过氧化物酶血红素和蛋白质部分分离，酶蛋白从天然状态转变到可逆变性状态，活力下降，且热稳定性低；在中型和碱性状态，酶处于天然状态，蛋白质结构含螺旋结构，稳定，酸化后螺旋结构破坏，产生结构。,2023/11/7,9,表8-1一些果蔬中的过氧化物酶的最适pH,2023/11/7,10,3.最适温度差异较大：35-60。不同来源的过氧化物酶在最适作用温度上存在着很大的差别。例如，马铃薯和花菜（均浆）中过氧化物酶的最适温度分别为55和3540。,2023/11/7,11,4过氧化物酶的热稳定性,4.1.热失活概念双向性：POD中含有不同的耐热性质部分，不耐热部分在热处理时很快地失活，而耐热部分在同样的温度缓慢地失活。,2023/11/7,12,在88热处理时甜玉米中过氧化物酶的失活（用邻-苯二胺作为氢体底物测定酶活力）,2023/11/7,13,可逆性：经热处理后的酶液在室温或较低温度下保藏，它的活力部分可以再生。例如：辣根过氧化物酶在70 加热1小时后，在30 下再生的酶活力可达到处理前的30-40%，而在50 下不能再生，如再降低到40 时，酶活力又开始提高。,2023/11/7,14,4.2.过氧化物酶冷冻增活效应果蔬热烫后，有多少残余活力或再生活力被允许留在被保藏的产品中，残余酶活力在冰冻保藏后，质量比酶完全失活时要高。,2023/11/7,15,4.3.非脂肪氧合酶作用在热失活中过氧化物酶分子聚集成寡聚体，分子量增加一倍，这个过程包括酶分子展开和展开的酶分子进一步堆积，血红素基暴露，增加了血红素蛋白非酶催化脂肪氧化的能力，导致不良风味的产生，这一过程非脂肪氧合酶作用（热烫钝化）。,2023/11/7,16,5 影响过氧化物酶热失活的因素,5.1.不同来源的POD具有不同的耐热性。一般来说，植物的过氧化物酶活力越高，它的耐热性也越高。比如马铃薯和花菜匀浆中的过氧化物酶在95加热10min就完全而不可逆地失活。而甘蓝中的过氧化物酶在120加热10min仍然有0.3%活力保存下来。,2023/11/7,17,5.2.低水分含量，POD耐热性增加：例如：水分含量低于40%时，谷类中过氧化物酶的热稳定性与水分含量成反比。对于加工脱水果蔬有重要参考价值。,2023/11/7,18,5.3.外加因素：降低pH，增加NaCl浓度。以辣根中过氧化物酶为例，加入羟高铁血红素能降低酶的热失活速度(pH 7.0、76)而升高温度能提高酶的热失活速度。在pH7时酶热失活的速度最低，在pH 4.0和pH10时酶热失活的速度分别提高到8倍和2倍。酶失活的初速度正比于NaCl的浓度(pH7.0、NaCl浓度低于0.6mo1L)，糖能提高苹果和梨中过氧化物酶的热稳定性。,2023/11/7,19,5.4.加热方式：pH确定，T确定，T变长，导致酶失活后可能性变大，HTST易导致酶再生。,2023/11/7,20,5.5.结合处理：微波和离子照射能降低在热烫过程中使酶失活所需的热处理强度。,马铃薯过氧化物酶的微波处理完全失活所需的时间,2023/11/7,21,辐射处理,在采用结合处理时，先使用辐射处理，再使用热处理。辐射时酶分子的聚集和单体的改性而使酶的热稳定性显著降低，且不会出现活力再生（辐射诱导水产生自由基二次进攻的结果）。,2023/11/7,22,6 化学试剂对过氧化氢酶的影响,6.1.使POD失活的作用方式：与酶结合失活作用于底物或产物,2023/11/7,23,6.2.化学试剂种类2.1 SO2和亚硫酸盐：SO2的作用仅仅是破坏H2O2 SO2+H2O 2H2O+SO30.1%-0.15%的焦亚硫酸盐能防止豌豆产生不良风味,2023/11/7,24,6.2.2 氰化物、叠氰化物和氟复合物：能与血红素结合，为可逆抑制。6.2.3 表面活性化合物：如单甘脂，卵磷脂等，显著失活。6.2.4 高分子物质：如果胶在pH5.5时，使POD显著失活；pH低，使POD完全失活。果胶的存在还能使POD最适pH从5.5移动至8.0，大多数果胶pH在酸性范围。这在食品加工中很重要。,2023/11/7,25,二、多酚氧化酶,多酚氧化酶（邻二酚：氧氧化还原酶；E1,10,3,1）在植物界乃至动物界分布广泛，由于其检测方便，是被最早研究的几类酶之一。,2023/11/7,26,引起食品酶促褐变的主要酶类,果蔬食品在加工及贮藏过程中存在褐变反应，而褐变的原因有非酶性的和酶性的，多酚氧化酶是引起食品酶促褐变的主要酶类，因此研究多酚氧化酶的特性对制定食品的加工与保藏工艺有非常重要的意义。,2023/11/7,27,有害：新鲜、冷冻、干制和罐藏产品的褐变。有利：红茶生产，苹果浓缩汁除涩三要素：底物、O2、酶,2023/11/7,28,1多酚氧化酶在自然界的分布,（1）广泛存在于自然界，植物、微生物及动物器官。植物品种不同，含量变化很大。果蔬中以橄榄含量最高。（2）PPO在植物细胞中分布取决于品种和年龄，果蔬而言还取决成熟度，如线粒体，叶绿体。（3）PPO在果蔬的不同部分含量存在很大差异。大多数水果中PPO以结合状态存在。葡萄皮中PPO活力高，葡萄成熟时PPO活力下降幅度最大。,2023/11/7,29,2多酚氧化酶催化的反应及其作用底物,2.1.催化反应：两类反应都需要有分子氧参加。(1)一元酚羟基化：(2)邻二酚氧化，生成邻醌。,2023/11/7,30,多酚氧化酶催化的氧化反应的最初产物邻醌将继续变化。相互作用生成高分子量聚合物。与氨基酸或蛋白质作用生成高分子络合物。氧化那些氧化还原电位较低的化合物，生成无色化合物。其中导致褐色素的生成，反应的产物是无色的。,2023/11/7,31,2.2.作用底物,儿茶素 3,4二羟基肉桂酸酯 3,4二羟基苯丙氨酸 酪氨酸,2023/11/7,32,3 多酚氧化酶抑制效应,酶促褐变三因素：酶，底物，O2。（1）对酶的抑制：PPO以铜为辅基的金属蛋白，金属螯合物，如抗坏血酸、柠檬酸、EDTA、果胶、氰化物。,2023/11/7,33,（2）与酶催化生成的反应产物作用,同邻二酚氧化产物醌作用的还原剂，如抗坏血酸、SO2、偏重亚硫酸盐。醌偶合剂：与醌作用，生成稳定的无色化合物，如半胱氨酸、谷胱甘肽、SO2、偏重亚硫酸盐。,2023/11/7,34,（3）清除酶作用的底物,与酚类底物作用的化合物：PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）与酚强烈缔合，消去底物。隔氧（4）热烫处理（灭酶）,2023/11/7,35,4光照强度与多酚氧化酶活性,多酚氧化酶属于植物体内的末端氧化酶系统，光照明显促进了此酶的活性。不同光照条件下海带体内酚类化合物含量的结果表明，在01200 Lx(勒克斯)间，PPO随光照强度增加而呈上升趋势。在对玫瑰组织培养的研究中，采用不同的遮光处理(对照、单层膜、双层膜)，其结果也同样证明在一定的光照强度变化幅度内，PPO活性和接种后的褐变率均随光强增加而上升。另外在茶叶研究中也有与此相一致的报道。,2023/11/7,36,三、脂肪氧合酶（lipoxygenase,LOX）,脂肪氧合酶（亚油酸：氧 氧化还原酶；EC 1.13.1.13）是近20年发现的与植物代谢有密切关系的一种酶，它属于氧化还原酶属的范畴，广泛存在于植物体中。研究认为，它可能参与植物生长、发育、成熟、衰老的各个过程，特别是成熟衰老过程中自由基的产生以及乙烯的生物合成，都发现有脂氧合酶的参与。因此脂肪氧合酶被认为是引起机体衰老的一类重要的酶。,2023/11/7,37,1 脂肪氧合酶催化的反应,图7-1脂肪氧合酶底物脂肪酸的部分结构,脂肪氧合酶的结构中含有非血红素铁，能专一催化含顺，顺1，4戊二烯的多不饱和脂肪酸及酯，通过分子加氢，形成具有共扼双键的氢过氧化衍生物。,2023/11/7,38,脂肪氧合酶对于它作用的底物具有特异性的要求，含有顺，顺1，4戊二烯的直链脂肪酸、脂肪酸酯和醇都有可能作为脂肪氧合酶的底物。最普通的底物是必需脂肪酸：亚油酸 CH3（CH2）4CHCHCH2CHCH(CH2)7COOH 亚麻酸CH3(CH2CH=CH)3(CH2)7COOH 花生四烯酸CH3(CH2)4(CH=CH-CH2)4(CH2)2COOH,2023/11/7,39,顺，顺1，4戊二烯单位的亚甲基在8位的脂肪酸异构体（亚油酸）是脂肪氧合酶的最佳底物。脂肪氧合酶作用于亚油酸时，能产生亚油酸的13L和9D氢过氧化物衍生物。,2023/11/7,40,2023/11/7,41,2 脂肪氧合酶作用的初期产物的进一步变化,如果将氢过氧化亚油酸看作为脂肪氧合酶的初期产物，那么它进一步变化的产物将十分复杂的，氢过氧化亚油酸变化的可能途径，它们包括：氢过氧化亚油酸的还原，过氧化物酶体系参与这类反应；酶催化氢过氧化亚油酸异构化成多羟基衍生物和酮：氢过氧化亚油酸的环氧化，这类反应发生在面粉水悬浊液体系之中；,2023/11/7,42,马铃薯中的酶催化氢过氧化亚油酸生成乙烯醚；在无氧条件下，脂肪氧合酶催化氢过氧化亚油酸和亚油酸发生二聚化反应，同时生成戊烷和氧代二烯酸等产物；氢过氧化亚油酸分解生成挥发性的醛和酮，是否有一种特殊的“裂解酶”参与这类反应还没有确定。,2023/11/7,43,氢过氧化亚油酸通过上述各种途径可以产生数以百计的不同产物，因此，同一种脂肪氧合酶能同时以合乎需要和不合乎需要的方式影响食品的质量，其中一些产物不会影响食品的感官质量，它们的生成，从某种意义上讲，通过竞争减少了另一些有损于食品感官质量的产物的生成。除了上述六种途径外，氢过氧化亚油酸还能与食品中非脂肪成分作用，从而进一步影响食品的质量。,2023/11/7,44,3脂肪氧合酶的作用对食品质量的影响,食品的质量取决于它的色、香、味。质构和营养价值。脂肪氧合酶的作用对食品质量的影响比较复杂，它既有助于提高一些质量指标，又能损害另一些质量指标。,2023/11/7,45,3.1 脂肪氧合酶的作用对焙烤食品质量的影响,脂肪氧合酶在焙烤工业中起着重要的作用。在面包等面制品的生产过程中，添加适量的脂肪酸氧合酶及大豆粉可使面粉中存在的少量不饱和脂肪酸氧化分解，生成具有芳香风味的羰基化合物，从而能改进面粉的颜色和焙烤质量。,2023/11/7,46,漂白面粉,在面粉中加入1%含脂肪氧化酶活力的大豆粉，可改善面粉的颜色和焙烤质量。脂肪氧合酶可通过偶合反应导致胡萝卜色素被漂白。,2023/11/7,47,强化面筋蛋白,大豆粉脂肪氧合酶在漂白面粉的同时还具有氧化面筋蛋白质的功能，从而对面团和烘焙食品产生有益的影响。在面粉中加入脂肪和大豆粉后，脂肪经脂肪氧合酶作用所生成的氢过氧化物起着氧化剂的作用。在后者的作用下，面筋蛋白质的巯基(SH)被氧化成SS，这对于强化面团中的蛋白质，即面筋蛋白质的三维网状结构是必要的。,2023/11/7,48,脂肪氧合酶还具有另外一个重要功能就是通过面筋蛋白质的氧化，防止脂肪的结合增加面团中游离脂肪的数量，这就保证了外加起酥脂肪能有效地改进面包的体积和软度。在游离脂肪释出时所伴随的面筋蛋白质的氧化，对于改进面团的流变性质是很重要的。在促使面筋蛋白质氧化的过程中，氧化脂肪中间物也起重要的作用。,改进面包的体积和软度,2023/11/7,49,3.2 脂肪氧合酶的作用对于食品颜色、风味和营养的影响,脂肪氧合酶作用于不饱和脂肪酸及脂时产生的初期产物，在进一步分解后生成的挥发性化合物对不同的食品的风味产生截然不同的影响。,2023/11/7,50,（1）对食品风味的影响,在一些水果和蔬菜中，例如番茄、豌豆、青刀豆、香蕉和黄瓜，这些挥发性化合物构成了人们期望的风味成分，然而在冷冻蔬菜和其他加工食品中，它们却产生了不良的风味。在谷类保藏过程中产生的不良风味也与脂肪氧合酶作用的初期产物的进一步分解有关。脂肪氧合酶还直接或间接地和肉类酸败及高蛋白质食品的不良风味有关。,2023/11/7,51,它作用的产物对维生素A及维生素A原的破坏；它的作用减少了食品中必需不饱和脂肪酸的含量；酶作用的产物同蛋白质的必需氨基酸作用，从而降低了蛋白质的营养价值及功能性质。,（2）脂肪氧合酶对食品营养的影响,2023/11/7,52,4 脂肪氧合酶的抑制,脂肪氧合酶会产生两种有害的副作用：一是造成有营养价值的多不饱和脂肪酸损失，二是产生导致酸败的氧化产物。在加工保藏期间产生不良的风味或导致食品在其他方面的质量的下降，因此，很多情况下，采用各种方法使脂肪氧合酶失活是十分必要的：主要包括控制温度和pH以及使用抗氧化剂。,2023/11/7,53,四、葡萄糖氧化酶（GOD）,Glucose Oxidase，简称GOD，-D-葡萄糖：氧化 氧化还原酶；EC1.1.3.4）是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化-D-葡萄糖成为葡萄糖酸和过氧化氢。,2023/11/7,54,1 葡萄糖氧化酶催化的反应,葡萄糖氧化酶的催化反应，按条件不同有如下三种形式：在没有过氧化氢酶存在下，每克分子葡萄糖氧化酶氧化时消耗1克分子氧。C6H12O6+O2 C6H12O7+H2O2,2023/11/7,55,在有过氧化氢酶存在下，每克分子葡萄糖氧化酶氧化时消耗1克原子氧。C6H12O6+1/2O2 C6H12O7在有乙醇和过氧化氢酶存在下，过氧化氢同时被用于乙醇的氧化作用，此时，每克分子葡萄糖氧化酶氧化时消耗1克分子氧。C6H12O6+C2H5OH+O2 C6H12O7+CH3CHO+H2O,2023/11/7,56,1.1 葡萄糖氧化酶的催化特异性,葡萄糖氧化酶与其他大多数酶一样，特异性非常严格。它对-D-吡喃葡萄糖表现出高度的专一性。葡萄糖氧化酶底物分子C（1）上的羟基在酶的催化作用中起到重要作用，且羟基处在-位时酶的活力比处在-位时高约160倍。底物分子中的任何一点改变都会显著降低其氧化速率。,2023/11/7,57,2葡萄糖氧化酶的分子组成及其作用机制,葡萄糖氧化酶以黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）为辅基，每克分子酶含2克分子FAD，来源不同，其分子量亦有所差别。目前葡萄糖氧化酶的工业酶制剂主要来源于黑曲霉，因此黑曲霉葡萄糖氧化酶是这类酶中研究得最为彻底的一种。黑曲霉葡萄糖氧化酶分子量为160000左右。,2023/11/7,58,实验数据证明，葡萄糖氧化酶催化的反应的速度同时取决于O2 和葡萄糖的浓度，反应遵循Ping Pong Bi Bi机制，可以用下面的图表来表示：,2023/11/7,59,图中G和L分别代表-D-葡萄糖和-D-葡萄糖酸内酯。也可以用下式描述葡萄糖氧化酶催化的反应：,2023/11/7,60,反应中，氧化态酶EFAD作为脱氢酶从-D-葡萄糖分子中取走两个氢原子形成还原态酶EFADH2和-D-葡萄糖酸内酯，随后-D-葡萄糖酸内酯非酶水解成D-葡萄糖酸，同时还原态葡萄糖氧化酶被分子氧再氧化成氧化态葡萄糖氧化酶。如果反应体系中存在过氧化氢酶，那么H2O2被催化分解成H2O和O2。,2023/11/7,61,3葡萄糖氧化酶在食品加工中的应用,葡萄糖氧化酶的作用归纳起来不外乎四个方面：一是去葡萄糖，二是脱氧，三是杀菌，四是测定葡萄糖含量。,2023/11/7,62,五 超氧化物歧化酶,超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，简称SOD,EC1.15.1.1）是一类含金属的酶。,2023/11/7,63,超氧化物歧化酶每克分子酶的氨基酸残基数在300个左右，它在生物界分布极广，广泛存在于需氧生物、耐氧生物及某些厌氧微生物中。目前已知的SOD主要分为三类，即Cu-Zn-SOD，Mn-SOD和Fe-SOD。Cu-Zn-SOD主要存在于包括人类在内的所有高等真核生物中，在真核细胞的细胞浆中分子量约为32000左右，呈兰绿色。,2023/11/7,64,Mn-SOD在高等生物的线粒体及细菌中均有发现。Fe-SOD只存在于原核细胞，分子量约在38000左右，呈黄色。三类SOD可能具有不同的进化祖先。SOD存在于几乎所有靠有氧呼吸的生物体内，从细菌、真菌、高等植物、高等动物直至人体均有存在。含SOD较高的天然植物有大蒜，其他如韭菜、大葱、油菜、柠檬和番茄等也含有。,2023/11/7,65,1催化机制,超氧化物歧化酶的作用机制：催化超氧阴离子的歧化反应。O2+O2+2HO2+H2 O2根据衰老的自由基学说，老化是自由基产生和清除发生障碍的结果。在生物体内由于作用外界和内在的因素，瞬间能产生大量的自由基。在正常情况下，产生和清除处于平衡状态。但随着机体的衰老，清除内能逐渐减弱，这种平衡被打乱，多余的自由基就能通过多种渠道损害机体。,2023/11/7,66,交联聚合,脂质过氧化物,蛋白质,导致胶原坚硬、长度缩短、失去膨胀力,不溶性蛋白质,皱纹和老年斑是如何产生的？,丙二醛,与磷脂酰乙醇胺交联,氧化酶,黄色色素,棕褐色色素,与蛋白质、胺类或脂类结合,2023/11/7,67,超氧化物歧化酶是专一清除氧自由基的清除剂。SOD能清除O2，同时生成H2O2，H2O2可被过氧化氢酶清除生成H2O 和O2。所以，SOD可清除机体代谢过程中所产生的过量O2，延缓由于自由基侵害而出现的衰老现象。,2023/11/7,68,2生理功能,2.1 SOD是特殊的氧自由基清除剂2.2 SOD具有电脑的防晒效果2.3 SOD有明显的抗炎效果,2023/11/7,69,思考题,1、简述过氧化物酶的分类及在果蔬加工中的重要性。2、简述酶促褐变机理及其控制措施。3、脂肪氧合酶作用机理是什么？4、超氧化物歧化酶的作用机理及其应用有哪些？,
