硫氧还蛋白过氧化物酶TPX活性测定试剂盒说明书.docx

硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)活性测定试剂盒说明书微法100T/96S注意：正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。澜定意义：TPX属于过氧化物酶家族,在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化作用,功能与GPX类似，也是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TPX普遍存在于各种生物体内，如酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫、细菌和古细菌，在进化上高度保守。TPX与细胞增殖、分化、细胞凋亡及肿痛发生调控密切相关。TPX的主要功能包括细胞脱毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。澜定原理：TPX催化H2O2氧化二硫苏糖醇(DTT),H2O2的吸收波长为240nm,通过测定24Onm吸光度的下降速率,即可计算出TPX活性。自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、和蒸储水试剂组成和配制：试剂一：液体12OmLXl瓶，室温保存。试剂二：液体20mLxl瓶，-20C保存。试剂三：液体2mLxl支，4七。粗液提取：1.组织：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为1：510的比例(建议称取约0.1g组织，加入ImL试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4C离心IOmin,取上清置冰上待测。2.细菌、真菌：按照细胞数量(IO4个)：试剂一体积(mL)为5001000:1的比例(建议500万细胞加入ImL试剂一)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min);然后8000g,4,离心IOmin,取上清置于冰上待测。3.血清等液体：直接测定。TPX涌定操作：取微量石英比色皿或96孔板，加入4L上清液，180L试剂二，16L试剂三，迅速混匀后于24Onm测定IOs和130s吸光度，记为Al和A2oTPX活性计算公式：a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下(1) .按蛋白浓度计算活性单位定义：25C或者37°C中，每亳克蛋白每分钟催化InmOlH26降解为1个酶活单位。TPX(nmol/minmgprot)=(A1A2)÷÷dV反总÷(CPrXV样)÷T=573×(A1-A2)÷Cpr(2) .按样本质量计算活性单位定义：25C或者37中，每克样本每分钟催化InmOlH2。2降解为1个酶活单位。TPX活性(nmol/min/g鲜重)=(AI-A2)+÷dV反总+(WXV样÷V样总)÷T=573×(A1-A2)÷W(3)按细胞数量计算活性单位定义：25C或者37中，每IO4个细胞每分钟催化InmolH2O2降解为1个酶活单位。TPX活性(nmol/min/l(Tcell)=(A1-A2)÷÷d×V反总÷(细胞数量XV样÷V样总)÷T=573x(AlA2)÷细胞数量(4)按液体体积计算活性单位定义：25C或者37中，每亳升液体每分钟催化InmOlH26降解为1个酶活单位。TPX活性(nmol/min/mL)=(Al-A2)÷+dV反总÷V样÷T=573×(A1-A2):H2O2的摩尔消光系数，43600Lmolcm=0.0436Lmolcm;d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积(L),200L=2×10-4L;Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)；W：样品质量：V样：加入反应体系中上清液体积(mL),4L=4×10-3niL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间(min),2min°b.使用96孔板测定的计算公式如下(1) .按蛋白浓度计算活性单位定义：25C或者37中，每亳克蛋白每分钟催化InmOlH22降解为1个酶活单位。TPX活性(nmol/minmgprol)=(AI-A2)÷÷dV反总÷(CPrXV样)÷T=1146×(AI-A2)÷Cpr(2) .按样本质量计算活性单位定义：25C或者37中，每克样本每分钟催化InmOlH22降解为1个醉活单位。TPX活性(nmol/min/g鲜重)=(AI-A2)+÷dV反总÷(WxV样÷V样总)÷T=1146×(A1-A2)÷W(3)按细胞数量计算活性单位定义：25C或者37°C中，每10$个细胞每分钟催化InmolH2O2降解为1个酶活单位。TPX活性(nmol/min/KTcell)=(A1-A2)÷÷dV反总÷(细胞数量XV样÷V样总)÷T=1146x(AlA2)÷细胞数量(4)按液体体积计算活性单位定义：25C或者37中，每亳升液体每分钟催化InmOlH22降解为1个酶活单位。TPX活性(nmol/min/mL)=(Al-A2)÷÷dV反总÷V样÷T=1146×(A1-A2)e：H2O2的摩尔消光系数，43600Lmolcm=0.0436Lmolcm;d：96孔板光径，0.5cm；V反总：反应体系总体积(L),200L=2×10-4L;Cpr：上清液蛋白质浓度(mg/mL)；W:样品质量：V样：加入反应体系中上清液体积(mL),4LMxlO-3mL；V样总：提取液体枳，1mL；T：反应时间(min),2mi11o