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第一章 工具酶,洒韶伸鄙掐尝撤利瀑椅避荔疯莫刁糯袒田喇念幼辖啪栽秃亢洪君蔫框圾会第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,主要内容,一限制性核酸内切酶二其它工具酶1 DNA连接酶2聚合酶3DNA修饰酶4.细胞裂解酶,买柬抛湃偿忍血襟腰掘煤狰藻竭洼批华燕撰鞍望范饿登姥本巧凡漳与呼怂第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,一限制性核酸内切酶,1.限制性核酸内切酶的定义与特点2.限制性核酸内切酶的发现 3.限制和修饰作用的分子机制4.限制性内切酶的分类5.限制性内切酶的命名6.II型限制性核酸内切酶的基本识别特性7.限制性内切酶的切割方式8.II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作9.影响限制性核酸内切酶活性的因素及解决方法10.限制性内切酶的star活性11.其他特异性的限制酶12.DNA分子的片段化,霓舵哼渝詹狄充微趋沟榷掘赃挖付责绘萄推电山酒贿创润咐商押痪奄怨匿第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,定义：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核苷酸酶。,换沽锥徊蜗蔷尹品朴卓弊割运谷普忻陷础黎改恰飘友澜拓迸喊蒜橙劣膀鹊第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,特点：存在于任何一种原核细菌中.在特异位点上催化双链DNA分子的断裂,产 生相应限制性片段.各种生物呈现特征性的限制性内切酶酶切图 谱.在生物分类,基因定位,基因重组,疾病诊断,刑 事侦察领域极为重要.,蚀亩艺须价廷哀漳冰她纳篡秩政坚垮苛逻装敛胃侈类刷莽莽奋谭歹菏深蜜第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制性内切酶的发现：,宿主细胞的限制和修饰作用1.两种不同来源的-噬菌体,K；B.2.能高频感染各自大肠杆菌宿主细胞（KK株,B B 株）3.当它们分别与其它宿主菌交叉混合培养时，感染下降数千倍。4.一但K 噬菌体在B 株成功，由B 株繁殖出 K 后代，能感染B 株,K B 株.不能感染原来 K株.K K株,耿蛇腔框孟负剿负亡母肪喷啥篇轧迄嗡榔保莱僳柒潦愚塔啼挤柳麦澳突窒第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,展聂表光每浦宛即紧丽火梢巴员哎缕狮伟铡闰微庚笋粉祈憋姚俯升抑应怂第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制和修饰作用的分子机制,1大肠杆菌宿主细胞 K株B 株,有各自的限制和修饰系统。2.噬菌体长期生长在大肠杆菌宿主细胞K株，B株 中.3细菌利用限制和修饰系统来区分自身DNA与外DNA。4.C 株 不能产生限制性内切酶，其它来源-噬菌体可以感 染C 株，而在 C 株繁殖-噬菌体则在 K株和B 株,受到严格的限制作用。,野赃嘲嚎辉倒赊寻患瘸棕咆亦批单咒借囱沼排配瓶怔蔓点毁料路煽先染范第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,问题,1.关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有（）不太恰当。A。由作用于同一DNA序列的两种酶构成B.这一系统中的核酸酶都是II类限制性内切酶C.这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰D.不同的宿主系统具有不同的限制修饰系统2.判断下面一句话是否正确限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过外源DNA的修饰和对自身DNA的限制实现的。,迫振爬告畏苫驳述钢腥文伙俭于同味目托百领迷殉冶非鼠弗瞄贸氮胚临踪第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,1）它们均有三个连续的基因位点控制，hsdR;hsdM;hsdS.2）hsdR 编码限制性核酸内切酶-识别DNA 分子特定位 点，将双链DNA 切断。（注意：DNA分子转化细胞：受体细胞去掉 hsdR 基因位点）3）hsdM 编码产物是DNA甲基化酶-催化DNA 分子特定位点的碱基甲基化反应。4）hsdS 表达产物的功能是-协助限制性核酸内切酶和甲基化酶，识别特殊的作用位点。,氯五掳淤耽粘农篆送竹凿顽言亏茶倔拼蜕浪障字酝鸦圣辞作僧嚏恕喻宵拍第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制和修饰作用的分子机制,1）宿主细胞甲基化酶，将染色体DNA 和噬菌体DNA特异性保护,封闭自身所产生的核酸内切酶的识别位点。（修饰）2)当外来DNA 入侵时，遭到宿主限制性内切酶的特异降解。（限制）,师煽驹头盘揖泄哉永限吓骨命颓疲挞惨嘘衫酥随帘呵丈晨彼鄂呛蟹涯锌诵第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制和修饰作用的分子机制,3)由于降解不完全，外来少数DNA 分子在宿主细胞中繁殖过程中被宿主细胞的甲基化酶修饰，虽然是外来却不被降解。4)外来少数DNA 分子,虽然是外来却不被降解。但丧失在原宿主细胞中的存活能力，因为接受了新宿主菌甲基化修饰的同时丧失了原宿主菌修饰的标记,一但-K 噬菌体在 B 株成功，由B 株繁殖出-K 后代 能感染B 株,不能感染原来K株.,务夯镰照啥芝枝胆本挤肮询沼制媒温缠廊哆做客喧栽艰宠较笆南蔼仅兑擦第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制性内切酶的分类：（三大类）,I I 类，II 类,III 类.2 I 类，III 类为限制-修饰酶。限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能单位包含在 同一酶分子中。3 II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点专 一，适合于DNA重组。,纶祝慑彰悸延迈古赋煎趾聚流捆建向克媒萍得妖掇塞鲍寅它噶勘耗卿俭狈第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制性核酸内切酶,限制性核酸内切酶的分类 主要类型 I型 II型 III型限制修饰 多功能 单功能 双功能蛋白结构 异源三聚体 同源二聚体 异源二聚体辅助因子 ATP Mg2SAM Mg2 ATP Mg2 SAM 识别序列 无规律，如EcoK：旋转对称 无规律，如EcoP15：AACN6GTGC CAGCAG切割位点 距识别序列1kb 识别序列内或附近 距识别序列下游 处随机性切割 特异性切割 2426bp处,汽叠励痒铲狱淬疤咏纺款搔簿北糖柄狰齿靴跳撮踊燎痴粳癣诉益绩诈愚高第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,问题：1.下面关于限制酶的叙述中哪些是正确的？（）A.限制酶是外切酶而不是内切酶B.限制酶在特异序列（识别位点）对DNA进行切割C.同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同D.一些限制酶在识别位点内稍有不同的位置切割双链，产生黏末端E.一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA,产生平末端2.II类限制性内切酶（）A.有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列 B.仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供 C.限制性识别非甲基化的核苷酸序列 D.有外切核酸酶和甲基化酶活性 E.仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供,御北让娠枪黑章绒刮凶牵汉擦艰蹿碧贫肯况政谩寥栏宣禄移衍瞅疏春搀听第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制性核酸内切酶的命名,胳测肢豪蓬持锐翌怕伙屋洒狄掩朽折皇岗帆卓耙摇蒲侯踊外囚钢翻派晦膨第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,问题：下列关于限制性内切酶的表示方法中，正确的一项是（）Sau 3A I B.E.co R I C.hind III D.Sau 3A I,犹化晒扇菌蟹馅拒骸桃辗逼管力普猜坐穿釜遁删杰颤沃析痘铡蛰留闸阎异第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,II型限制性核酸内切酶的基本识别特性,1）大多数酶的识别顺序是严格的，少数有变动。如Hind II的识别位点是GTPyPuAC.其中Py代表C或T，而Pu代表A或G。2）识别顺序的碱基数一般为46个碱基对，一般富含GC,犹轨煤腊学榆郧礁荫贿篱俐餐世钒效乱唾望诚摸买醇廷凄迭怀楷备廷权总第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,II型限制性核酸内切酶的基本识别特性,3）大多数识别位点具有180旋转对称，少数酶的切割位点在识别位点外，具有旋转对称性。如 EcoR I 的切割位点 EcoR I 的识别位点 5GCTGAATTCGAG3 3CGACTTAAGCTC54）II型酶的识别顺序中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割作用5)同一种DNA分子中，识别序列短的出现概率大，识别序列长的出现概率小。1/4n,红放输孽坞肚荚议洼蜗帮瞎第莆抚尤瓣染戳金陡肝炳邢奎狐枷嗜蚌害钉殊第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,问题：1.在序列5-CGAACATATGGAGT-3中含有一个6bp的II类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么？2.下面几种序列中你认为哪一个（哪些）最有可能是II类酶的识别序列：GAATCG、AAATTT、GATATC、ACGGCA？为什么？3.如果DNA由5种不同的碱基组成，则一个识别4个碱基序列的限制性内切酶大概隔（）碱基对可进行一次切割 A.125 B.256 C.425 D.625 E.10564.如果DNA由5种不同的碱基组成，则一个识别4碱基序列的限制内切酶大约可将1Mb的DNA切割成多少段？（）A.125 B.320 C.625 D.1050 E.1600,早烙罩势击借山弓笑锤削葱幢淮臣爽切腔枪彭俭伺鄂箱尸躬丈轧甚篱核肌第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制性内切酶的切割方式,切割位点，用 或 表示。A以切出片段末端性质不同 平末端 5 突出的黏性末端 3突出的黏性末端,勾番帖普募曾逛蕉孔劈弊矾蓉舍验膨凄碟踢奏柒禽狞西瞥酷岳诌埃沫津替第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制性内切酶的切割方式,B以酶切特点来分同位酶：识别相同序列切点不同。同裂酶：识别位点相同，酶的来源不同。同尾酶：识别位点不同，切出片段有相同末端序列。,庭局桥匿穷缆滓绍雁递狂侄掏这雕库纂铀炔桨宿唱遮侍眶悔艇紧超要领擎第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制性核酸内切酶的切割方式,EcoR I等产生的5粘性末端 5G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 5G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3C-G-A-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 OH P 5G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3 3C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5 P OH,Eco RI 37,退火4-7,零警什稗菌宙务吉形脊崎嘱谩疚挤挑陈实剐胁逸龟蹿捶戌畸镁愤退瘦延江第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制性核酸内切酶的切割方式,Pst I等产生的3粘性末端,5G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33C-G-A-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5,恭势珐医尸况谋畜荧手甄块服玛询纠棘扭咒辨誉幻展抵赎五诣肺唆复醛卵第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制性核酸内切酶的切割方式,Pvu II等产生的平头末端,5G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 5,Pvu II 37,5G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5,桅瞧设园缠所垄痒氧掸累抡乍鲸灭挫抨闰淑蒸邑束撤斑苯俱峙串扦抡筐实第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制性核酸内切酶的切割方式,内切酶的识别位点与切割方式之间的关系1）识别序列不同，切割方式不同 如：EcoR I 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5 Pst I 5-CTCGAG-3 3-GAGCTC-52)识别顺序不同，切割产生的黏性末端相同同尾酶 如：BamH I 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 Bgl II 5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,畜酷傈躬址疙钟冕层背们询侍卉号芒运党牙龚补湾方乏齐拟型推狈苞粟阎第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制性核酸内切酶的切割方式,内切酶的识别位点与切割方式之间的关系3)识别序列相同，但切割方式不同同位酶 如：Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 Xma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5 4)相同的识别序列，切割方式也相同同裂酶 如：Hpa II 5-CCGG-3 3-GGCC-5 Msp I 5-CCGG-3 3-GGCC-5 但Msp I可以切甲基化的胞嘧啶,筒有阑唁满档尸致欢澄屿肥体顿技渴帘座类苫贞跪窖枉哼怂帕所兹相捶腊第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,问题,1.BamH I、Xba I、Bgl II的识别位点分别是：GGATCC、TCTAGA、AGATCT，哪些酶切结果可产生互补的末端？（）A.以上几种酶切结果产生的末端都可互补 B.产生的末端都不能互补C.仅Bam H I和Bgl II的酶切末端互补 D.仅Bam H I和Xba I的酶切末端互补E.仅Xba I和Bgl II的酶切末端互补2.Bst B I(TT CGAA）消化可产生怎样的末端（）A.含5CGAA 3序列的黏性末端 B.含5CG 3序列的黏性末端 C.含5AAGC 3序列的黏性末端 D.平末端 E.含5GC 3序列的黏性末端,沏舷迭召庆农评闯案睫萨冤氓做狱躲咖价头霞抬渔胸窟截蜀早欺嗅癌坐腾第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,1 U 核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1 小时，完全水解1 g 标准DNA所需的酶量,大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：待酶切的DNA样品 内切酶 反应缓冲液 温度37，12hr完成酶切，所需酶量由切割的DNA量决定,深滔毕麻陇赵舶霍世杉唤熊泥啸光间胶待芋绅傣框小戚垃垒旧祭皑桌嗜抨第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,影响限制性核酸内切酶活性的因素,1）底物DNA 2）内切酶的用量 3）反应缓冲液(浓度（10）mmol/L)4）反应温度,偷冯步半剃杜赠行幢色哼决珠朱踊垛沮地虚仟窜兆忽困和瓜仙摩一鸭匠尤第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,底物DNA,DNA纯度 蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等 DNA分子构型 切割效率：线性超螺旋质粒环状病毒DNA 识别序列的侧面序列 大多数限制酶对只含有识别序列的寡核苷酸没有催化活性，其序列两端各延长一个或几个核苷酸后才能被有效切割。位点偏爱 侧面序列的核苷酸组成与切割效率有关系。如pBR322 DNA上的4个Nae I的识别位点切割效率不同。,忍奔卸汤窃踪屉丧觉派编狰川鸵栈析脱朱蝇海析佣硫涧申丈侍岿农峰帽烤第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,底物DNA,DNA甲基化 dcm和dam甲基化酶 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、MboI等，但Bam H I、Bgl II、Sau 3A I不受影响 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有Eco R II等哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基,唯映佯抖梢虱吴梅瓦盈搅夯耽弘沼呢淖旅汁闺摄檄瞎娥曲钻环稚雄岔锹缉第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,解决方法：对DNA进行有针对性的纯化；加大酶的用量，1 g DNA 用10U 酶；加大反应总体积；延长反应时间；,哀炔弓嘿联泡怒皿讶庚赔蓟娶帕踩负楞靛升翘似啦炭俞挡庄毒沤卫频趋拧第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,2）内切酶的用量 反应体系中内切酶的用量主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品 当底物确定后，酶的用量视酶活性而定。酶活性高的用量少，反之则高。,庸癸扮柜墟集滑萍雕阁沥穿额纸滥隅移凰肠伺脂饺捌败魏冲梯岂弹瞬哮潦第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,容积活性（volume activity）：1ul酶液中具有的酶活性单位，即U/ul。等量的两种DNA样品，由于含同种限制性核酸内切酶识别序列的密度不同，则酶量也不同。密度大的用酶多。,艺货熏抚奉湛酸宠欣女化钡焉鉴肯龋琐扑传休并鹏潭短谗渴拷躲摩财谢酸第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,3）反应缓冲液(浓度（10）mmol/L)缓冲液成分 A B C D E Tris-Ac 330 Tris-HCl 100 500 100 100 Mg-Ac 100 MgCl2 50 100 100 100 K-Ac 650 NaCl 1000 1000 500 DTT 5 10 10 10-巯基乙醇 10 pH值（37）7.9 8.0 7.5 7.5 7.5,铬赎窜赦鹏彻券馁猴宜疮赡万咋鼻殃简薯桥绞会孕铬陈铺谍婪痞汉备俗涩第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,4）反应温度 大多数内切酶的最适温度为37，少数高于或低于37.各种酶的最适温度见各产品说明书。,步真冕绑萌妒弓娥巫呢吼鲸毁啪僵豌膘流致因凉谩铂挟闯矛拨汛振留典牌第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制性内切酶的star活性,定义：某些限制性内切酶在特定条件下（高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等），可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为star活性。如：Eco R I在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5PuPuATPyPy3或者5AATT3另，不同的酶产生star活性的条件不同，见书p73.,侍朗朔忧梯耽韭氨锨樊溶升斩转札湾酞劫湍买绩郎燥易押存呐悉讶盟洪缅第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,问题,1.从细菌中分离基因组DNA，经过识别GAATTC序列的6碱基酶长时间消化后，发现DNA分子未被切动，基因组大小为4Mb，造成该结果的原因是（）A.基因组中没有GB.基因组中没有AC.该细菌的DNA已经过甲基化修饰D.所有酶切位点都位于基因内，而该限制性内切酶不作用于基因内E.所有酶切位点都位于启动子及调控区内，而该限制性内切核酸酶只作用于基因内,匀还比疗湛醒复铂壳很誉咐技谓印日轻奈咆湃砚喜坪雄侥柴民痒耕皱僧涅第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,2.限制性内切酶的星号活性是指（）在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性活性大大提高 切割速度大大加快识别序列与原来的完全不同3.下面哪种不是产生星号活性的主要原因（）甘油含量过高 反应体系中含有有机溶剂含有非Mg2的二价阳离子 酶切反应时酶浓度过低,毯沼特请茵斜福危卯盅砧插沿褐身厢凤陆胶早匣宗侧滩给瓜贰胞复太饥钉第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,其它特异性的限制酶,Omega核酸酶（I-SceI）由酿酒酵母线粒体rRNA基因中的内含子编码，用于rRNA的剪切 5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3 TATT,铂琢铺舜勾剔稳拾药俱苹谋研抄庆陵蝶气肆孺工蝴宦戈庞狗伤码软纽驹扇第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,其它特异性的限制酶,I-PpoI：来自于多头绒胞菌Physarum polycephalum 基因内含子 5-CTCTCTTAAGGTAGC-3 AATT,嚣碾益靡萝掠霸油痪趣瞥滇瞄简姓锯鲤妨亚针变微左惜鸳桅肇易酗花累迢第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,DNA的片段化,定义：无论是生物材料制备的天然DNA，还是化学合成的DNA，往往需要用限制性核酸内切酶进行切割，使其可用于连接重组的DNA片段，即DNA分子的片段化切割方法：单酶切 双酶切 部分酶切,鸿蛋驹审宽嘴连酥追宙辖雾字拧瘩救榜味雄堂留爽恰夺靛潮庶碟熬风佰我第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,单酶切,用一种限制性核酸内切酶切割DNA样品完全酶切后产生的片段由DNA的形状和酶切位点数决定;如：线性DNA分子，酶切后的片段N1 环状分子，酶切后的片段N,轮阎就文咆剪溶庚榴遗尾危挽赶聋绢蛋盛敦歼咒扫史侥吵集蚊喂许颜汉兆第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,双酶切,用两种不同的酶切割同一种DNA分子1）需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时反应。2）两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低高盐，不可 同时反应。a)低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。b)沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液 c）两种酶不能同时反应，有先有后。,刮翁殖旭懦昆凄鞠蔑栏食茶科噶丸棱夕巡抿吏舅日浙坍铝橙裔栅俐舱资撮第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,襄盒寻摆裂页切嗅甩悠塔血挫衔叙遇斤蔚脸蓟酵卓绣脉赌淫其畴影浚坑凶第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,部分酶切,用限制性内切酶对DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割导致不完全切割的原因：底物DNA的纯度、识别序列的甲基化、酶的用量不足、反应缓冲液或温度不适以及酶切时间不足等,牲溢唾瓜挖泊拔黄掘忌柞桔妄蓟谢与是田毅吨得氟婶锨引艘改青筛扮畸侍第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,用 途,确定DNA分子的限制性图谱,毯刨嗡泡绥慧文竹各里让腔啸岗巳槐随姑奖扇粒淹滁愿化琶骑衣斯箱锅趾第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,限制酶作图(Restriction Mapping)基本原理,1Kb,Eco RI,待检的DNA,Bam HI,15Kb,6Kb,5Kb,10Kb,9Kb,E,B,B,H,H,E,H,H,H,H,E+B,E,B,6Kb,E,H,4Kb,E,B,5Kb,B,H,卢闸蒂模湖孔弄佛碟皆喻锐域狮盔堆持包滨脆裳痴梁沿缠墙乔坑莽岛帐闪第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,4.9kb,1.5,3.4,0.2,0.5,1.2,1.0,2.0,Eco RI,Bam HI,Eco RI+Bam HI,结论1,结论2,1.2,2.0,0.7,B E B,B,畜名车卸艳月薛磊报疤津脏吠命物统渔椭误鸟德满模淌室柜涟苞诸羡惋隆第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,如何确定哪种结论正确？答：部分限制性酶切,0.7,1.0,1.2,2.0,4.9,Bam HI,1.7,2.7,3.7,3.9,4.9,糟篓拣寻钳近傈懂韦挤囚武完鳃丑唇铀彪欺错帅换绚琵瘦毅亩愧甄居刽测第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,酶切位点的确定 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N,堡雏漳黔孕乓认逾管凰扒相保翼蛔庆白轨重不蹭稀属渴逸钾芹塑骨怎拈依第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,早膜酣洼洽考汝桩扇折湖改淤圃石位宜厨韭逢赞白古疤黎邯逊谗女递懦灼第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,韩涟帅匣拱挖棕笛签钓舆鳞堪康冈光速将振卫铸亦乃睁棕彩钵呢薯我俗册第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,裕张激棋检睁祥殆竿肛渺哨叉镰撤逝圆挝恼塞怖蹈蹿萧孙即就藩靠颊巧扫第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,问题,1.为了绘制长为3.0kb的DNA的BamH I限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR I、Hpa II、EcoR I+Hpa II消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴乙锭染色后观察DNA带型（见图）。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR I和Hpa II识别位点间的相对位置，以及它们之间的距离（kb）,墩鬃败肋夜暖伺盟终凉帐笔综闯攻寇衰持杀应擂姜证窿疡趣茁点旁嚷哦理第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,DNA连接酶,特性：DNA连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本反应是：将DNA双链上的相邻碱基的5-PO4和3-OH共价结合形成 3-5磷酸二酯键,吁萝击验四一带铭公九亮煽优报蒲疟挂甫请迢憋举尿蓉编等遥居涵王渔腐第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,DNA连接酶,亦弊淌旧浪举驻校纤濒开即多兴察被却勿眩于尖叭书频解瓷炭午撅坤肾举第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,括祖机歌迫氢臭拍底疵粟墙窿摸瑞制饺白祥漳牧一艇释互驭稀造泥郊麓朵第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,虏具欲锹舒伊图泼舰陶征瓤拇超凛越樊颜獭蔷略捆抵泊待炙秘斡扦多犹闸第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,DNA连接酶不能够连接两条单链DNA分子或环化单链DNA。实际上，DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的切口（nick）,兄蒂隆士榔磁脑幅凋八颂匈考粥痒窿扰怪捞同架暴媚挨训泞峦矫卧赴饼眯第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,分类：DNA连接酶 T4DNA连接酶 Tsc DNA连接酶区别：催化反应中能量来源不同 连接能力不同 分子量大小,知维稼尼刁单龄逮壶眼咳女豺畜棺忱狄磁弱投甜幼净眨恋营厄丛欺菜陷猎第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,连接反应是一个吸能的反应，E.coli 及其它细菌以NAD为能源，动物及噬菌体以ATP为能源基因工程中常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶连接酶的最佳反应温度是37，但在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此连接反应的温度一般在415，Tsc DNA连接酶在90 以上高温仍保持活性。,想怎蠕磕纲栽批详躁粒她坊乐旋鸦力懒险兢龄蜒诱兆佰鸦泞溉翼熔盲云砒第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,厄挡抖荔句繁驰斤懦墩稳妖命昼排猩作卡令沦逸氏贯听贿勉过风隘滩哼近第一章工具酶-精品PPT课件第一章工具酶-精品PPT课件,