微生物营养与培养.ppt

第五章 微生物营养与培养,第一节 微生物的营养需求,第三章 微生物的营养,微生物同其他生物一样都是具有生命的，微生物细胞直接同生活环境接触并不停地从外界环境吸收适当的营养物质，在细胞内合成新的细胞物质和贮藏物质，并储存能量，微生物从环境中吸收营养物质并加以利用的过程即称为微生物的营养（nutrition）。,一、微生物细胞的化学组成 微生物细胞化学组成成分析表明，与其他高等动植物细胞一样，细胞也是大量元素碳、氢、氧、氮、磷、硫（这六种元素占细菌细胞干重的97）和微量元素铁、锰、锌等构成。微生物细胞中这些元素主要以蛋白质、糖、脂、核酸、维生素及它们的降解产物、代谢产物等有机物质，水和无机盐等无机物质的形式存在。水是细胞中的一种主要成分，一般可占细胞干重的90以上。,微生物细胞物质中灰分元素含量的百分比,微生物细胞中几种主要元素的含量（干重的百分数）,微生物细胞的化学组成,二、微生物的营养物质及其生理功能,通过了解微生物的化学组成，可见微生物在新陈代谢活动中，必须吸收充足的水分以及构成细胞物质的碳源和氮以及钙、镁、钾、铁等多种多样的矿质无素和一些必须的生长辅助因子，才能正常地生长发育。,（一）水分 水分是微生物细胞的主要组成成分，大约占鲜重的7090。不同种类微生物细胞含水量不同。同种微生物处于发育的不同时期或不同的环境其水分含量也有差异，幼龄菌含水量较多，衰老和休眠体含水量较少。微生物所含水分以游离水和结合水两种状态存在，两者的生理作用不同。结合水不具有一般水的特性，不能流动，不易蒸发，不冻结，不能作为溶剂，也不能渗透。游离水则与之相反，具有一般水的特性，能流动，容易从细胞中排出，并能作为溶剂，帮助水溶性物质进出细胞。微生物细胞游离态的水同结合态的比例为41。微生物细胞中的结合态水约束于原生质的胶体系统之中，成为细胞物质的组成成份，是微生物细胞生活的必要条件。游离水是细胞吸收营养物质和排出代谢产物的溶剂及生化反应的介质；一定量的水分又是维持细胞渗透压的必要条件。由于水的比热高又是热的良导体，能有效地调节细胞内的温度。微生物如果缺乏水分，则会影响代谢作用的进行。,（二）碳源物质 凡是可以被微生物利用，构成细胞代谢产物碳素来源的物质，统称为碳源物质。碳源物质通过细胞内的一系列化学变化，被微生物用于合成各代谢产物。微生物对碳素化合物的需求是极为广泛的，根据碳素的来源不同，可将碳源物质分为无机碳源物质和有机碳源物质。糖类是较好的碳源，尤其是单糖（葡萄糖、果糖）、双糖（蔗糖、麦芽糖、乳糖），绝大多数微生物都能利用。此外，简单的有机酸、氨基酸、醇、醛、酚等含碳化合物也能被许多微生物利用。所以我们在制作培养基时常加入葡萄糖、蔗糖作为碳源。淀粉、果胶、纤维素等，这些有机物质在细胞内分解代谢提供小分子碳架外，还产生能量供合成代谢需要的能量，所以部分碳源物质既是碳源物质，同时又是能源物质。在微生物发酵工业中，常根据不同微生物的需要，利用各种农副产品如玉米粉、米糠、麦麸、马铃薯、甘薯以及各种野生植物的淀粉，作为微生物生产廉价的碳源。这类碳源往往包含了几种营养要素。,（三）氮源物质 微生物细胞中大约含氮513，它是微生物细胞蛋白蛋和核酸的主要成分。氮素对微生物的生长发育有着重要的意义，微生物利用它在细胞内合成氨基酸和碱基，进而合成蛋白质、核酸等细胞成分，以及含氮的代谢产物。无机的氮源物质一般不提供能量，只有极少数的化能自养型细菌如硝化细菌可利用铵态氮和硝态氮在提供氮源的同时，通过氧化产生代谢能。微生物营养上要求的氮素物质可以分为三个类型：1空气中分子态氮 只有少数具有固氮能力的微生物（如自生固氮菌、根瘤菌）能利用。2无机氮化合物 如铵态氮（NH4+）、硝态氮（NO3-）和简单的有机氮化物（如尿素），绝大多数微生物可以利用。3有机氮化合物 大多数寄生性微生物和一部分腐生性微生物需以有机氮化合物（蛋白质、氨基酸）为必需的氮素营养。在实验室和发酵工业生产中，我们常常以铵盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、鱼粉、血粉、蚕蛹粉、豆饼粉、花生饼粉作为微生物的氮源。,（四）无机元素 微生物细胞中的矿物元素约占干重的310左右，它是微生物细胞结构物质不可缺少的组成成分和微生物生长不可缺少的营养物质。许多无机矿物质元素构成酶的活性基团或酶的激活剂；并具有调节细胞的渗透压，调节酸碱度和氧化还原电位以及能量的转移等作用。微生物需要的无机矿质元素分为常量元素和微量元素。常量矿质元素是磷、硫、钾、钠、钙、镁、铁等。磷、硫的需要量很大，磷是微生物细胞中许多含磷细胞成分，如核酸、核蛋白、磷脂、三磷酸腺苷（ATP）、辅酶的重要元素。硫是细胞中含硫氨基酸及生物素、硫胺素等辅酶的重要组成成分。钾、钠、镁是细胞中某些酶的活性基团，并具有调节和控制细胞质的胶体状态、细胞质膜的通透性和细胞代谢活动的功能。微量元素有钼、锌、锰、钴、铜、硼、碘、镍、溴、钒等，一般在培养基中含有0.1mg/L或更少就可以满足需要。,(五)生长因子 生长因子是微生物维持正常生命活动所不可缺少的、微量的特殊有机营养物，这些物质在微生物自身不能合成，必须在培养基中加入。缺少这些生长因子就会影响各种酶的活性，新陈代谢就不能正常进行。生长因子是指维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等特殊有机营养物。而狭义的生长因子仅指维生素。这些微量营养物质被微生物吸收后，一般不被分解，而是直接参与或调节代谢反应。在自然界中自养型细菌和大多数腐生细菌、霉菌都能自己合成许多生长辅助物质，不需要另外供给就能正常生长发育。,第二节 微生物对营养物质的吸收,微生物不象动物那样具有专门的摄食器官，也不象植物那样具有根系吸收营养和水分，它们对营养物质的吸收是借助生物膜的半渗透性及其结构特点以几种不同的方式来吸收营养物质和水分的。如果营养物质是大分子的蛋白质、多糖、脂肪，微生物则分泌出相应的酶（这类在细胞内产生，分泌到细胞发挥作用的酶称为胞外酶）将大分子降解成小分子后，再吸收利用。各种物质对细胞质膜的透性不一样，就目前对细胞膜结构及其传递系统的研究，认为营养物质主要以以下几种方式透过细胞膜。,三 微生物的营养类型 根据生长所需要的营养物质的性质，可将生物分成两种基本的营养类型异养型生物：在生长时需要以复杂的有机物质作为营养物质自养型生物：在生长时能以简单的无机物质作为营养物质 动物属于异养型生物，植物，而微生物既有异养型的也有自养型的，大多数微生物属于异养型生物，少数微生物属于自养型生物。根据生长时能量的来源不同，又可将生物分成两种类型化能营养型生物：依靠化合物氧化释放的能量进行生长光能营养型生物：依靠光能进行生长 动物和大部分微生物属于化能营养型生物，它们从物质的氧化过程中获得能量。植物和少部分微生物属于光能营养型生物,光能自养型微生物以C02作为唯一碳源或主要碳源，并利用光能，以无机物如硫化氢、硫代硫酸钠或其他无机硫化物作为供氢体将CO2还原成细胞物质，同时产生元素硫 光能 CO2H2S CH2O+2S+H2O 光合色素 光能自养型微生物包括蓝细菌（含叶绿素）、红硫细菌和绿硫细菌等少数微生物（含细菌叶绿素），由于含有光合色素，因而能使先能转变成化学能（ATP），供机体直接利用。,光能异养型微生物以CO2为主要碳源或唯一碳源，以有机物（如异丙醇）作为供氢体，利用光能将CO2还原成细胞物质，红螺菌属中的一些细菌属于此种营养类型。光能 2(H3C)2CHOH+CO2 2CH3COCH3+CH2O+H2O 光合色素光能异养型细菌在生长时大多数采要外源的生长因子,化能自养型微生物 以CO2或碳酸盐作为唯一或主要碳源，以无机物氧化释放的化学能为能源,，利用电子供体如氢气、硫化氢、二价铁离子或亚硝酸盐等使CO2还原成细胞物质。这类微生物主要有硫化细菌、硝化细菌、氢细菌与铁细菌。它们在自然界物质转换过程中起着重要的作用。,化能异养型微生物 多数微生物属于化能异养型，其生长所需要能量和碳源通常来自同一种有机物。根据化能异养型微生物利用有机物的特性，又可以将其分为下列两种类型：腐生型微生物：利用无生命活性的有机物作为生长的碳源。寄生型微生物：寄生在生活的细胞内，从寄生体内获得生长所需要的营养物质。存在于寄生与腐生之间的中间过渡类型微生物，称为兼性腐生型或兼性寄生型。,四、微生物吸收营养物质的方式,单纯扩散促进扩散主动运输基团移位,1、单纯扩散(simple diffusion or passive diffusion),被输送的物质，靠细胞内外浓度为动力，以透析或扩散的形式从高浓度区向低浓度区的扩散。特点：扩散是非特异性的营养物质吸收方式：如营养物质通过细胞膜中的含水小孔，由高浓度的胞外环境向低浓度的胞内扩散；,在扩散过程中营养物质的结构不发生变化：即既不与膜上的分子发生反应，本身的分子结构也不发生变化；物质运输的速率较慢：速率与胞内外营养物质的浓度差有关，即随细胞膜内外该物质浓度差的降低而减小，直到胞内外物质浓度相同；不需要载体参与；扩散是一个不需要代谢能的运输方式，因此，物质不能进行逆浓度运输；可运送的养料有限：限于水、溶于水的气体，及分子量小，脂溶性、极性小的营养物质。,osmosis,flows towards high salt concentrations,单纯扩散模式图,细胞膜外,细胞膜内,细胞膜,营养物通过与细胞膜上载体蛋白（也称作透过酶permease）的可逆性结合来加快其传递速度。,2、促进扩散(facilitated diffusion/transport),营养物质本身在分子结构上不会发生变化；不消耗代谢能量，故不能进行逆浓度运输。运输的速率由胞内外该物质的浓度差决定；需要细胞膜上的载体蛋白（透过酶）参与物质运输；被运输的物质与载体蛋白有高度的特异性；养料浓度过高时,与载体蛋白出现饱和效应；促进扩散的运输方式多见于真核微生物中。,Embeded protein:,3、主动运输(Active transport),在代谢能的推动下，通过膜上特殊载体蛋白逆养料浓度梯度吸收营养物质的过程,需要消耗代谢能；可以进行逆浓度运输的运输方式；需要载体蛋白参与；对被运输的物质有高度的立体专一性；被运输的物质在转移的过程中不发生任何化学变化。,Comparison of passive and active transport,不同微生物在主动运输过程中所需的能量来源不同，好氧微生物直接来自呼吸能，厌氧微生物主要来自化学能，光合微生物则主要来自光能。主动运输是微生物吸收营养物质的主要方式。,基团移位是一种特殊的主动运输，与普通的主动运输相比，营养物质在运输的过程中发生了化学变化（糖在运输的过程中发生了磷酸化）。其余特点与主动运输相同。基团移位主要存在于厌氧和兼性厌氧型细菌中，也主要是用于单（或双）糖与糖的衍生物，以及核苷与脂肪散的运输,4、基团移位(Group translocation),运送机制:是依靠磷酸转移酶系统,即磷酸烯醇式丙酮酸-己糖磷酸转移酶系统.运送步骤:1.热稳载体蛋白(HPr)的激活 细胞内高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基团把HPr激活。PEP+HPr 丙酮酸+P-HPrHPr是一种低分子量的可溶性蛋白，结合在细胞膜上，具有高能磷酸载体的作用。,酶1,2.糖被磷酸化后运入膜内 膜外环境中的糖先与外膜表面的酶II结合，再被转运到内膜表面。这时，糖被P-HPr上的磷酸激活，并通过酶II的作用将糖-磷酸释放到细胞内。P-HPr+糖 糖-P+HPr酶II是一种结合于细胞膜上的蛋白，它对底物具有特异性选择作用，因此细胞膜上可诱导出一系列与底物分子相应的酶II。,酶II,四种运输营养物质方式的比较,第五节 培养基(medium),定义：应科研或生产的需要，由人工配制的、适合于不同微生物生长繁殖或积累代谢产物用的营养基质（混合养料）。特点：任何培养基都应具备微生物所需要的六大营养要素，且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。用途：促进微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品。,培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）物理化学条件适宜（条件适宜）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）,一、培养基的配制原则,（一）培养基组分应适合微生物的营养特点,即根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基；不同营养类型的微生物，其对营养物的需求差异很大。如自养型微生物的培养基完全可以（或应该）由简单的无机物质组成。异养微,生物的培养基至少需要含有一种有机物质，但有机物的种类需适应所培养菌的特点。按微生物的主要类群来说，它们所需要的培养基成分也不同：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基；LB(Luria-Bertani)放线菌：高氏一号培养基 真菌：查氏合成培养基；PDA(Potato-Dextrose-Agar)酵母菌；麦芽汁 当对试验菌营养需求特点不清楚的时候，可以采用“生长谱”法进行测定。,浓度过高微生物的生长起抑制作用，浓度过小不能满足微生物生长的需要。碳氮比（C/N）直接影响微生物生长与繁殖及代谢物的形成与积累，常作为考察培养基组成时的一个重要指标；,速效性氮（或碳）源与迟效性氮（或碳）源的比例 各种金属离子间的比例,碳源中的碳原子的mol数氮源中所含的氮原子的mol数,C/N比值=,例：谷氨酸生产中C/N 4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；C/N3/1 时，菌体生长受抑制，而谷氨酸大量增加。,（二）营养物的浓度与比例应恰当,（1）pH：各类微生物的最适生长pH值各不相同：细 菌：7.08.0放线菌：7.58.5 酵母菌：3.86.0霉 菌：4.05.8 在微生物的生长和代谢过程中，由于营养物质的利用和代谢产物的形成与积累，培养基的初始pH值会发生改变，为了维持培养基pH值的相对恒定，通常采用下列两种方式：内源调节：在培养基里加一些缓冲剂或不溶性的碳酸盐；调节培养基的碳氮比。外源调节：按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液,（三）物理化学条件适宜,各种微生物对培养基的氧化还原电势的要求：好氧微生物：+0.3+0.4V,(在0.1V以上的环境中均能生长)。厌氧微生物：只能在+0.1V以下生长。兼性厌氧微生物：+0.1V以上呼吸、+0.1V以下发酵。培养基是多氧化还原偶的复杂电化学系统，测出的Eh值仅代表其综合结果。对微生物影响最大的是：分子氧和分子氢的浓度。培养基中常用的还原剂：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等。,（3）氧化还原电势(redox poyential),二、培养基的类型,（一）根据成分划分 1天然培养基(complex medium;undefined medium)是利用一些天然的动植物组织器官和抽提物，如牛肉膏、蛋白胨、麸皮、马铃薯、玉米浆等制成。它们的优点是取材广泛，营养全面而丰富，制备方便，价格低廉，适宜于大规模培养微生物之用。缺点是成分复杂，每批成分不稳定。我们实验室常用的牛肉膏蛋白胨培养基便是这种类型。2合成培养基(defined medium;synthetic medium)是利用已知成分和数量的化学物质配制而成。此类培养基成分精确，重复性强，一般用于实验室进行营养代谢、分类鉴定和选育菌种等工作。缺点是配制较复杂，微生物在此类培养基上生长缓慢，加上价格较贵，不宜用于大规模生产。如实验室常用的高氏1号培养基，察氏培养基。3半合成培养基(semi-defined medium)用一部分天然物质作为碳氮源及生长辅助物质，又适当补充少量无机盐类，这样配制的培养基叫半合成培养基。如实验室常用的马铃薯蔗糖培养基。半合成培养基应用最广，能使绝大多数微生物良好地生长。,（二）根据物理状态划分 1液体培养基(liquid medium)把各种营养物质溶解于水中，混合制成水溶液，调节适宜的pH，成为液体状态的培养基质。该培养基有利于微生物的生长和积累代谢产物，常用于大规模工业化生产和观察微生物生长特征和研究生理生化特性。2固体培养基(solid medium)一般采用天然固体营养物质，如马铃薯块、麸皮等作为培养微生物的营养基质。亦有在液体培养基中加入一定量的凝固剂，如琼脂（1.5%2.0%）、明胶等煮沸冷却后，使凝成固体状态，常用来观察、鉴定和分离纯化微生物。3.半固体培养基(semi-solid medium)加入少量凝固剂（0.50.8的琼脂）则成半固体状态的培养基叫半固体培养基，常用来观察细菌的运动，鉴定菌种噬菌体的效价滴定和保存菌种。,（三）根据用途划分 1.基础培养基 含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基。2.加富培养基 根据培养菌种的生理特性加入有利于该种微生物生长繁殖所需要的营养物质，使微生物生长旺盛，如加入血、血清等以培养营养要求比较苛刻的微生物。加富培养基主要用于菌种的保存或用于菌种的分离筛选。3.选择培养基 根据某种或某一类微生物特殊的营养要求，配制而成的培养基，如纤维素选择培养基。还有在培养基中加入对某种微生物有抑制作用，而对所需培养菌种无影响的物质，如在分离霉菌时常在培养基中加入抗生素。4.鉴别培养基 根据微生物的代谢特点通过指示剂的显色反应用以鉴定不同微生物的培养基。5.生产用培养基 在生产实践中经常用孢子培养基、种子培养基和发酵培养基。,三、培养基的制备方法,1 配制前的准备 2 配制方法的选择 3 配制操作 4 配制结果的验证 5 注意事项,第三节 微生物的营养需求与生产原料的处理,一、微生物营养需求与食品生产原料的选择1、水 生产实际中应当控制液体培养基营养物质浓度小于12%，水占88%左右；控制固体培养基水分大于45%。2、碳源和氮源 不同种类微生物利用碳源和氮源的种类和能力不同，这是食品生产原料选择的重要依据。3、无机盐和生长因子 是微生物生产不可缺少的营养物质，实际发酵生产中，为使菌种顺利生长通常个别添加无机盐和生长因子。,二、生产用培养基的配制与食品原料处理1、原料除杂 采用人工挑选、过筛、漂洗、磁力除铁器等方法出去原料中的各种杂质。2、原料粉碎 食品生产中很多原料需要粉碎，通过粉碎破坏原料组织结构，增加原料表面积，提高原料利用率等，包括组织破碎和细胞破碎。3、营养物质浓度及配比 主要通过不同的食品生产工艺，使大分子营养物质转变为小分子营养物质，有效控制碳氮比。,二、生产用培养基的配制与食品原料处理4、pH调节与无机盐和生长因子 pH调节在整个生产过程中进行，无机盐可直接加入。5、灭菌 食品生产中很多原料需要粉碎，通过粉碎破坏原料组织结构，增加原料表面积，提高原料利用率等，包括组织破碎和细胞破碎。3、营养物质浓度及配比 也采用湿热灭菌的方法，使用大型蒸料锅或采用直接、间接在发酵罐中通入饱和蒸汽的方法进行。,