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酶免疫技术,病从口入，严格把关！,高效！快速！,禽畜疫病；真菌毒素；激动剂类；抗生素；其他：三聚氰胺，苏丹红。,经典标记技术,三大经典免疫标记技术,酶标记技术的催生,1941，Coons，荧光标记免疫技术,1956，Berson&Yalow，放射标记免疫技术,1966年，Nakane&Pierce，“酶标抗体：制备和应用于抗原的定位”,20世纪70年代，酶标记检测技术飞速发展,原理及特点,主要试剂:酶标记的抗体或抗原酶标物特点：免疫学活性 酶对底物的催化活性,抗原抗体反应的特异性,+,酶高效催化反应的专一性,原理及特点,原理：酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析,特点：灵敏度高、特异性强、准确性好酶标记试剂能够较长时间保持稳定操作简便、对环境没有污染易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的新方法,酶免疫测试（EIA）技术分类,酶免疫分析技术,非均相酶免疫分析,均相酶免疫分析,非均相液相酶免疫分析,非均相固相酶免疫分析,以聚苯乙烯制品作为载体的酶联免疫吸附实验-ELISA,主要内容,第一节 酶免疫技术的基本条件,第二节 ELISA的种类,第三节 ELISA 基本操作步骤,第四节 dot-ELISA,第五节 酶免疫技术在食品检测中的应用,第一节 酶免疫技术的基本条件,1.1 标记酶的特点,1.自然界分步广泛，易纯化。2.性质稳定，比活高。3.酶结合物稳定，便于观察和保存实验结果。4.酶催化底物的显色信号易于判断和测量。5.方法敏感，重复性好，简单易行。6.酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉。,1.2 常用于酶免疫技术的酶,辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase,HPR）碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase)半乳糖苷酶（-Gal）酸性磷酸酶葡萄糖过氧化酶溶菌酶,1.3 酶和酶作用底物,RZ值：403nm（辅基）与275nm（主酶）OD值之比,-糖蛋白（主酶）-亚铁血红素（辅基）-主酶与酶活性无关-辅基是酶的活性中心,酶活（高比活性）：RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要.,底物为H2O2：催化物无色还原型染料生成有色氧化型染料,辣根过氧化物酶,1.3 酶和酶作用底物,辣根过氧化物酶（HRP）的底物,H2O2为受氢体，HRP对受氢体的专一性很高,供氢体DH2习惯上被称为底物，底物有多种,1.3 酶和酶作用底物,-2,2-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)铵盐。,-TMB反应后显蓝色，加酸终止反应后变为黄色，测定波长450nm，稳定，无致癌性，ELISA中应用最广泛的底物。,-OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，致癌性。,辣根过氧化物酶HRP,5-氨基水杨酸5-ASA,四甲基联苯胺 TMB,HRP常用底物,1.3 酶和酶作用底物,碱性磷酸酶（AP）,半乳糖苷酶（-Gal）,性质：磷酸酯水解酶；底物：催化磷酸化合物（单酯、核苷、糖）水解释放磷酸盐，同时生成有色或荧光物质；来源：菌源性AP，肠粘膜AP。,底物：半乳糖苷，邻硝基酚半乳糖苷，乳糖（测葡萄糖含量）；来源：米曲霉。,1.3 酶和酶作用底物,AP的底物,-Gal的底物,对-硝基苯磷酸酯（pNPP）：经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm。,4-甲基伞酮基-D半-乳糖苷（4MUG）：酶作用后，生成高强度荧光物，用荧光计测量。,底物的选择与使用,1.容易获取。2.性质稳定。3.对人的健康没有危害或危害小。4.与相应酶反应后产生肉眼可见的明显变化。5.与相应酶反应时间适中（固相酶免疫，1030min；酶免疫组织化学，几分钟）。6.与相应酶反应条件不苛刻。,底物应具备的特点,1.3 酶和酶作用底物,2.酶标记抗原或抗体,2.1 酶标记抗原或抗体条件,抗原或抗体,制备方法要求,抗原要求纯度高，抗原性完整。抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。,技术方法简单、产率高，重复性好。标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性。酶标记物稳定，不形成聚合物。,2.2 酶标记抗原或抗体方法,2.3 酶标记抗原或抗体纯化及鉴定,标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度 常用的纯化方法：葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化 50%饱和硫酸铵沉淀提纯酶标物的摩尔比：,2.3 酶标记物保存,酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠）。,3、固相载体,固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面。固相抗体或抗原是非均相酶免技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法。,载体要求,结合抗体或抗原的容量大 抗体或抗原牢固地固定在其表面 不影响免疫反应性 利于反应充分进行 固相方法简便易行，快速经济,3、固相载体,3.1种类,微量酶标板或试管 聚苯乙烯等纤维素膜 dot-ELISA小球状物载体：琼脂糖珠（Sepherose 4B）,良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。,3.2、固相载体具备的特点,第二节 ELISA 的种类,ELISA,直接法,间接法,双抗夹心法,竞争法,1.直接法,将样品和标准抗原直接包被在微孔板上，经过温育、洗涤、封闭等一系列步骤，加入酶标记的抗体，与微孔板上的抗原充分反应。直接法是最简单的ELISA分析方法，但是样品中非特异性吸附干扰影响很大，并且抗原吸附一般也不完全。,包被抗原,封闭蛋白,酶标抗体,底物,加入显色液后经12分钟显淡蓝色,加入终止液终止反应，溶液变为黄色，即可读数,直接法原理,2.间接法,间接法 ELISA（Indirect ELISA）将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗人IgG或IgM抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子只需要变换包被抗原，就可用一种酶标二抗检测各种与抗原结合的抗体。,包被抗原,封闭蛋白,第一抗体,酶标第二抗体,底物,加入显色液后经12分钟显淡蓝色,加入终止液终止反应，溶液变为黄色，即可读数,间接法原理,3.双抗夹心法,3.1 双抗体夹心法,双抗体夹心法ELISA 将特异性抗体包被于固相载体表面，与标本中相应抗原相结合，洗涤后再加入酶标的第二特异性抗体与抗原结合，加入底物后显色。,包被抗原,封闭蛋白,酶标第二抗体,底物,加入显色液后经12分钟显淡蓝色,加入终止液终止反应，溶液变为黄色，即可读数,双抗夹心法原理,第一抗体,双抗体夹心法特点,优点：灵敏度高，特异性强。需要制备两种抗体来检测抗原，两种抗体要求可以识别不同的抗原决定簇。提纯免疫球蛋白和制备酶标记物要求技术性强。对二抗的要求较高，需要对抗血清进一步分离纯化。典型的二抗制备方法是用木瓜蛋白酶将抗体水解为两个Fab片断和一个Fc片断，在Fab片断的羧基段键合辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶。缺点：不适用于小分子检测，要求检测抗原至少具有2个抗原决定簇。,双抗原夹心法测抗体原理,双抗原夹心法测抗体原理与双抗体夹心法测抗原原理类似，不同的是包被固相载体用的是抗原，与待检样品结合的是酶标抗原。,3.2 双抗体夹心法,4.竞争ELISA,竞争ELISA原理-标本中的抗原（抗体）和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体（抗原）结合，标本中的抗原（抗体）含量越多，结合在固相上的酶标抗原（抗体）越少，显色越浅。要用于小分子抗原、半抗原或小分子抗体的定量测定，也可对抗体进行测定。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。,包被抗原,封闭蛋白,第一抗体,酶标第二抗体,底物,待测抗原,与间接ELISA不同，此时第一抗体和待测抗原一同加入到孔中,除了和包被抗原结合的抗体，其余的待测抗原、第一抗体以及它们的结合物都在随后的洗板过程中离开反应体系,底物显色程度可知包被抗原的多少，由此可推知待测物种的抗原含量,包被抗原与待测抗原共同竞争与第一抗体进行结合,竞争ELISA原理,竞争法在操作上比直接法多一步预混合的步骤，即在酶标板上加入样品和抗体之前，需要将这两者以一定比例混合，预孵育一定时间。显色后用酶标仪测定其吸光度。各孔的吸光度值与样品中抗原的浓度成反比。,竞争ELISA,4.竞争ELISA,第三节 ELISA 基本操作步骤,包被抗原,封闭蛋白,第一抗体,酶标第二抗体,底物,加入显色液后经12分钟显淡蓝色,加入终止液终止反应，溶液变为黄色，即可读数,应注意避免溶血 在5 天内测定的血清标本可放置于4、超过一周测定的需20保存尽量避免反复冻融（少量分装）,第二节 ELISA 基本操作步骤,1.标本,第二节 ELISA 基本操作步骤,将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。,2.包被,第三节 ELISA 基本操作步骤,2.1 包被方式,亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。脂类物质 无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。优点：试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。,第三节 ELISA 基本操作步骤,2.2 包被抗原,天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。,第三节 ELISA 基本操作步骤,2.3 包被抗体,IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。,第三节 ELISA 基本操作步骤,2.4 包被条件,pH9.6碳酸盐缓冲液pH7.2的磷酸盐缓冲液pH7-8的Tris-HCL缓冲液,a.加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜，37中保温2小时。b.包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。c.一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。,第三节 ELISA 基本操作步骤,3.封阻,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（5%）。,在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加入未知浓度的待检抗原时，应对其进行梯度稀释，已取得合适的工作浓度。,第三节 ELISA 基本操作步骤,4.加样,过量的抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，此现象称为钩状效应,钩状效应（Hook Efect）,保温方式：ELISA仪器附有特制的电热块，水浴。若用保温箱：ELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。,第三节 ELISA 基本操作步骤,5.温育,第三节 ELISA 基本操作步骤,6.洗涤,洗涤液,在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液；ELISA过程中至少需要4次洗涤。,洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：,第三节 ELISA 基本操作步骤,7.洗涤,1）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。2）浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。,显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。,第三节 ELISA 基本操作步骤,8.显色,酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。,第三节 ELISA 基本操作步骤,8.显色,9.比色,第三节 ELISA 基本操作步骤,第三节 ELISA 基本操作步骤,9.比色,拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。结果以光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法为A492nm或OD492nm。,阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称。在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。,10.对照设置,第三节 ELISA 基本操作步骤,阴性对照品须先行检测确定不含待测物质或结构与其相似的物质。参考标准品：定量测定应含有制作标准曲线用的参考标准品。,10.对照设置,第三节 ELISA 基本操作步骤,将测得的吸光度值OD490nm扣除空白后，按照下面的公式换算成抑制结合率B/B0(%)：B/B0(%)(OD-NSB)/(OD0-NSB)100其中，OD为给定样品的吸光度值；OD0为阳性对照的吸光度值；NSB为阴性对照的吸光度值。以抑制结合率B/B0(%)为纵坐标，浓度的对数值Log10(抗原)为横坐标作图，绘制标准曲线，标准曲线用Boltzmann方程拟合y=a+b/1+exp(x-c)/d，其中a,b,c,d为方程拟合参数。,11.数据处理,第三节 ELISA 基本操作步骤,竞争法ELISA可以有两种作标准曲线方式:1、结合率lg(浓度)；2、OD浓度,ELISA分析常见问题及其原因,重复性不好：加样量多少不一，操作时间长短不一；加入标本后没有混匀。,假阳性多，本底高甚至花板：加样时污染；加酶时污染；反应温度太高；稀释倍数太高；洗板次数不够方法不当。,显色浅，灵敏度低：试剂盒运输或保藏条件不当；过期；温育时间或温度不够；加样量不足；显色剂不足。,ELISA试剂盒,试剂盒：Kit，用于盛放检测化学成分、药物残留、病毒种类等或实现某个生化反应的化学试剂的盒子。,原则上ELISA可用于检测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。ELISA在实际应用方面可作疾病的临床诊断、疾病监察、疾病普查、法医检查、兽医及农业上的植物病害的诊断检定等。所以ELISA试剂盒具有很广的市场，加之其后期生产成本低廉，于是极具商业价值。,著名ELISA试剂盒厂商,德国拜发,英国朗道,日本IBL,奥地利Bender Medsystems,美国（Invitrogen）Biosource,丹麦 IDS,国内ELISA试剂盒厂商,思考题,1酶免疫技术的要点？2酶联免疫吸附试验的原理（ELISA）？3竞争法在酶联免疫检测应用中的原理和应用？4常用的底物有哪几类？特点？5常用的酶有哪几类？特点？6何谓包被与封闭？其作用？7常用固相载体的种类和特点？8举例固相酶免疫测定应用的原理及影响因素。9ELISA的非特异性干扰有哪些，其机制？10对酶免疫技术的应用评价如何？,