水稻对南方水稻黑条矮缩病抗性鉴定技术规程.docx

水稻对南方水稻黑条矮缩病抗性鉴定技术规程1范围本文件规定了水稻品种（资源）抗南方水稻黑条矮缩病（病原：南方水稻黑条矮缩病毒Southernriceblack-streakeddwarfvirus,SRBSDV）田间病圃鉴定和人工接种鉴定的技术方法。本文件适用于水稻品种（资源）对南方水稻黑条矮缩病的抗性鉴定和抗南方水稻黑条矮缩病水稻种质资源筛选。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T15794稻飞虱测报调查规范NY/T2631南方水稻黑条矮缩病测报技术规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。11感病对照品种TNlTN1：高感南方水稻黑条矮缩病的轴型常规水稻品种XX本地1号，简称感病品种TNL感病株表现南方水稻黑条矮缩病症状的水稻植株。感病株率病株占调查水稻植株总数的百分率。无毒白背飞虱经检测不携带南方水稻黑条矮缩病毒的白背飞虱。有效鉴定株数分孽盛期或拔节初期存活的参鉴水稻株数。4原理南方水稻黑条矮缩病主要是由白背飞虱带毒引起，该病的发生轻重与水稻品种抗性、白背飞虱的虫源基数和带毒率、耕作制度、白背飞虱迁入期与水稻敏感期的吻合度等关系密切，一般同时具备以上有利于病害发生的条件，病害必将发生较重。病害发生率基本等于损失率，一旦大面积暴发，将造成严重减产（90%以上），甚至绝收。5试剂与设备可调控温光的养虫室（温度保持于（26±1）C范围内，相对湿度80%90%,光照每天12h）;100OmL玻璃或透明塑料杯、尼龙纱布（网眼规格Imm）、养虫架、适宜白背飞虱繁殖的水稻种子（宜采用白背飞虱喜食性品种如TNl等）；转移白背飞虱用黑布、试管、吸虫管等。6田间病圃鉴定6.1 田间自然诱发鉴定6.1.1 鉴定病圃的选择与设置在螟虫发生较轻且白背飞虱常稳定发生地区，选择四周种植白背飞虱适生寄主且近年重发南方水稻黑条矮缩病田块（上年度水稻感病对照品种TNl在不防治条件下分槃期病株率大于30%,抽X黄熟期达到50%以上的田块）作为田间鉴定病圃。6.1.2 鉴定病圃的试验设计6分行初步筛选将不同播期TNI秧苗充分混合移栽做保护行和诱发行，每行TNI单本移栽6株，保护行或诱发行之间预留10株参试品种空间。水稻参试品种按同样规格单本移栽于TNl保护行或诱发行之间，各品种移栽3行，每行10株，试验在秧苗和XX期均呈随机区组排列，重复3次。6.1.2,2小区重复鉴定各参试品种及对照均单本移栽于诱发行与保护行之间，各小区移栽12行，每行10株，试验设计同分行初步筛选。6.1.3 播种与移栽在常年第一代白背飞虱迁入或发生高峰前7dIOd播种感病对照品种TNl,每隔IOd再播种一次，共播种3次4次，直至第一代白背飞虱迁入或田间白背飞虱已形成一定的种群数量。参试品种播种一次，播种时期较当地生产常规播种期晚5dIOdo种子经浸泡、催芽、育苗移栽方式种植。育秧方式为湿润育秧，苗床上感病对照品种TNl撒播，参试品种分行条播，苗床首尾及每10行参试品种间隔播种一行感病对照品种TNl,播种密度为30kg40kg667m2o播种后30d35d移栽，每品种单木移栽，株行距为15CmX18cmO6.1.4 水肥管理灌溉水与常规管理一致。秧田期较常规管理增施尿素5kg667XX管理较常规肥水管理增施尿素IOkg667m2.以增强对传毒介体向背飞虱的引诱，诱发南方水稻黑条矮缩病。6.1.5 鉴定圃施药鉴定圃全生育期不使用抗病毒剂，二代若虫发生期之前不使用杀虫剂，在苗床和拔节初期用阿维菌素或甲氨基阿维菌素苯甲酸盐防治一次稻纵卷叶螟和螟虫。6.1.6 白背飞虱虫量及带毒率调查6.1.6.1虫量调查白背飞虱一代成虫发生峰期调查苗床，五点取样，分蕤盛期在XX平行跳跃取样，每块田取样3丛，参照GBZT15794-2009,用瓷盘拍虫法统计虫量。6.1.6.2带毒率调查XX间一代白背飞虱成虫发生高峰期，在鉴定圃捕捉高龄若虫或成虫500头以上，从中随机选取100头，参照附录A用RT-PCR检测或Dot-ELISA（NY/T2631-2014附录C）检测种群带毒率。6.1.6.3有效传毒虫量计算田间鉴定的有效传毒虫量用FVS表示，按式（1）计算。FVS=N×PVS（1）式中：FVS田间鉴定的有效传毒虫量，单位为头每公顷（头hm2）；PVSN白背飞虱虫量，单位为头每公顷（头/bn?）；白背飞虱带毒率，单位为百分率（）。计算结果精确到小数点后两位。当尸VS值处于L5X1()66.0X1()6头hm2范围内，方可认为试验有效。6. 2病情调查7. 2.1调查时间和内容8. 2.1.1拔节期调查参试水稻品种进入拔节期后，每隔7d调查一次，直至所有品种进入拔节期。调查有效鉴定株数和明显矮缩不能拔节株数。6抽X黄熟期调查参试水稻品种抽X黄熟后，每隔7d调查一次，共调查3次4次，直至所有品种均进入全X黄熟期，调查参试水稻的存活株数和存活、死亡的病株数。6. 2.2病株标准7. 2.2.1分票、拔节期症状病株分蕤增多丛生，上部数片叶的叶枕重叠，心叶破下叶叶鞘而出或从下叶枕口呈螺旋状伸出，叶片短而僵直，叶尖略有扭曲畸形。严重发病植株矮小，不能拔节；多数单株能够拔节，矮化症状明显或不明显。8. 2.2.2抽X黄熟期症状重病单株已矮化、死亡。轻病株全株或一个以上分篥明显矮化常伴有高位分蕤，不能抽X,或相对抽X迟而小、实粒少、粒重轻，半包在叶鞘里，颖壳全部或部分变褐色，剑叶短小僵直；在中上部叶片基部可见纵向皱褶；在茎秆下部节间和节上可见蜡白色或黑褐色瘤状突起。以黄熟期初期植株有1个以上不孕、不实(结实粒少于全X1/3)分孽症状为感病单株判定标准。9. 2.2.3南方水稻黑条矮缩病病情级别及症状见附录B表B2o10. 2.3相对发病率计算抽X黄熟期调查、计算感病对照的感病株率，若出现感病对照品种TNl的感病株率未达80%,则认定本鉴XX果不可用。抽X黄熟期感病株率用RT表示，数值以计，按式(2)计算:Rif=（nif+nd）/Cntf+nd）×100%（2）式中：Rif抽X黄熟期感病株率，单位为百分率（）；n,f抽X黄熟期感病株数，单位为株；分蕤期感病株且在抽X黄熟期死亡株数，单位为株；ntf抽X黄熟期存活总株数，单位为株。计算结果精确到小数点后两位。相对发病率凡表示，数值以计，按式（3）计算：Rr=RMRSfX100%（3）式中：R1一抽X黄熟期相对发病率，单位为百分率（）；Rif抽X黄熟期感病株率，单位为百分率（）；Rxf抽X黄熟期感病对照的感病株率，单位为百分率（）；计算结果精确到小数点后两位。7人工接种鉴定7.1 接种用白背飞虱的准备7.1.1 白背飞虱的采集白背飞虱若虫或成虫采集自田间。7.1.2 无毒白背飞虱种群的获得选取饲喂白背飞虱的水稻种子用水浸种24h后，纱布覆盖，恒温箱（32土2）催芽（24h48h）,选取发芽良好的种子（25粒30粒）均匀播于盛有自然肥力土壤的塑料杯中（内径80mm-HOmm）；大约6d7d后,待苗长至1.5叶期时，将待产的单头白背飞虱移入杯中产卵，约3d后将成虫移出，单独保存，7dIod后孵化出若虫。按NY/T2631-2014附录C的规定对产卵的白背飞虱进行检测，筛选其中无毒白背飞虱的后代进行繁殖，每批随机取出30头50头白背飞虱进行带毒率检测，带毒率始终为0%,则该批白背飞虱为无毒白背飞虱种群。7. 2病株准备7. 2.1病株的采集在重病区采集表现南方水稻黑条矮缩病疑似症状的水稻植株种植在防虫网笼中的塑料桶中。7. 2.2病株检测确定采病株叶片按NY/T2631-2014附录C的规定或参考附录A进行检测，确认感染南方水稻黑条矮缩病毒则作为毒源保存，并经白背飞虱接种扩繁病株。11. 3饲毒方法将7.2的病株种于大烧杯（内径100mm200mm）中，土面覆盖滤纸，将适量1龄2龄无毒白背飞虱移入其中，并用60目防虫网封口。饲毒2d后将虫移入塑料杯（内径80mm110mm,预先育有白背飞虱喜食品种如TNl的秧苗）中饲养，Hd后，每批随机取出30头白背飞虱普龄若虫或成虫，按NY/T2631-2014附录C的规定检测白背飞虱种群带毒情况，计算白背飞虱种群的带毒率。11.4 苗方法参试品种（含感病对照）经6.1.3方法浸种、催芽：选取30粒左右发芽良好的种子均匀播于盛有自然肥力土壤的塑料杯（内径80mmIlOmm）中。每参试品种重复3次。11.5 种时期水稻幼苗生长至1.52叶龄期。7. 6接种方法及数量选取7.3已饲毒且度过循回期的白背飞虱成虫接种种群，并计算有效接种虫量，人工接种鉴定的有效接种虫量用/V5表示，数值以头/苗计，按式（4）计算：IVS=N×PVS（4）式中:IVS人工接种鉴定的有效接种虫量，单位为头/株；N接种白背飞虱数量，单位为头。当/VS值处于12头/株范围内，方可认为试验有效。从接种种群中随机抽取50头以上虫，测定带毒率，计算接虫数量后接入已育有参试品种的塑料杯（内径80IlOmm）中，接种时间为2d,接种温度（26±1）C,且每天上午和下午各赶虫一次，使白背飞虱分布均匀，2d后用杀虫剂将接种用白背飞虱全部扑杀，将秧苗移出塑料杯，至1530C条件下培育，常规管理，定期观察植株发病情况。7.7调查时间接种20d后进行调查；共调查3次，每次调查间隔期不少于7d,第一次调查时同时确定有效鉴定株数。7.8调查标准7. 8.1南方水稻黑条矮缩病苗期发病症状秧苗叶色浓绿，叶片短小僵直，心叶扭曲；植株矮化不明显，茎杆或叶背有纵向不规则蜡白色瘤状突起，后变黑褐色；植株矮小，叶色稍浓绿。8. 8.2病株标准出现或症状的植物直接记为病株；出现症状的植株，用DOl-ELISA（按NYZT2631-2014附录C的规定）或RT-PCR检测确认（参考附录A）。9. 9相对发病率计算若出现感病对照的平均感病株率小于30%,则重复进行试验。按式（3）方法计算相对发病率。苗期感病株率用&表示，数值以计，按式（5）计算：Ril=mtlnlt×100%（5）式中：Ril苗期感病株率，单位为百分率（）；flic苗期感病株数，单位为株;ntt接种病毒的总株数，单位为株。计算结果精确到小数点后两位。8水稻品种抗南方水稻黑条矮缩病性状的评价8.1 抗性分级标准田间鉴定和人工接种鉴定均根据相对发病率进行抗性评价，抗性分级标准见表BI南方水稻黑条矮缩病抗性评价分级标准，以最后的抗性表现为准。10. 2抗性评定当品种抗性在不同地区间、不同年度间或批次间鉴XX果表现不一致时，以最差的抗性表现为准。9汇总报告格式9.1试验概况概述试验目的、鉴定材料、鉴定单位、鉴定方法与评价标准等基本情况。9. 2结果与分析以各试验组别为单位，分析评价各品种的抗性表现，列出相应的数据表。格式参照附录C的表Clo11. 3小结与讨论首先根据感病对照品种鉴XX果阐明该年度抗性鉴XX果的有效性，再对试验品种的抗性概况进行简要描述。附录A（资料性附录）南方水稻黑条矮缩病毒检测技术-RT-PCR法A.1试剂除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器，可用1DEPC（焦碳酸乙二酯）水处理后高压灭菌并分装。A.1.1液氮：可保存于液氮罐或保温桶中。A.1.2TRIzolReagents（购于Invitrogen公司）。A.1.3氯仿。A.1.4异丙醇：-20。C预冷。A.1.575%酒精（DEPC水配制）。A.1.6DEPC7K：用1DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA。A.1.7X脂糖。A.1.8Tris碱。A.1.9冰乙酸。A.1.10EDTA（0.5molL）。A.L1150XTAE配方:TriS碱242g；冰乙酸57.1ml；EDTA（0.5molL）100mL定容至IOoom1。A.1.12PrimeScriptOneStepRT-PCRKit一步反转录试剂盒（购自宝生物工程（XX）有限公司）。A.1.14DNAMarker（国产）。A.1.15Gelred核酸染色工作液（国产，购于XX李记生物科技有限公司）参照使用说明进行。A.2仪器设备称量天平：精度等级为001g°A.2.2高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上）0A.2.3冰箱（28和-20。C两种）。A.2.4微量可调移液器（2L.IOL,100L.1000L）及配套带滤芯吸头。A.2.5EppendorfW（0.2mL、1.5mL、2.0mL）。A.2.6研碎。A.3检测引物正向引物SRB-sio-F5,-ccACAtcgcgtcAccaaactAC-3,反向引物SRB-SlO-R5,-CGGTCTTACGCAACGATGAACC-3,A.4试验操作A.4.1采样工具下列采样工具必须经（121±2）。15min高压灭菌并烘干：剪刀，镒子，研钵，EPPendOr潸（0.2mL、1.5mL、2.0mL）,吸头。A.4.2样品采集用剪刀剪取新鲜水稻叶片或茎秆组织，放入密闭的自封袋内（一个采样点的样品，放一个塑料袋），置于装有液氮的保温桶内，尽快运回实验室4。C条件下保存待检，存放不能超过7d。A.4.3样品保存新鲜样品若需长期保存应置于-70。C以下，避免反复冻融（冻融不超过3次）。A.4.4样品处理A.4.4.1取水稻组织0.1g,放入研钵中，倒入适量液氮，以研磨棒将样本磨碎至粉末状,转移至EPPendorf管中。A.4.4.2按照0.1g样品/ImLTRIzolreagent,加入适量TRlZolreagent,充分混匀。A.4.4.3每ImLTRIZolreagent加入0.2mL氯仿，盖好管盖，充分震荡15s,室温静置5min；12000r/min，4离心15min。.4.4.4吸取A各管中的上清液转移至新的Eppendorf管中，切勿吸到中间层，向Eppendorf管中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置IOmin。A.4.4.512000rmin,4离心IOmin,弃上清,加入600L75%乙醇，上下颠倒洗涤。A.4.4.612OOOrZmin,4离心5min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），弃上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品须在吸水纸不同地方沾干）。A.4.4.74000r/min离心IOS（EPPendOM管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到沉淀，室温干燥3min5min;不能过于干燥，以免RNA不溶。A.4.4.8加入10L15LDEPCzK,轻轻混匀，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增；若需长期保存须放置-70。C冰箱。A.4.5检测A.4.5.1扩增试剂准备从试剂盒中取出相应的RT-PCR反应液，设所需RT-PCR检测总数为n,其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制见表A1。表Al每个样品测试反应体系试剂使用量终浓度PrimeScript1StepEnzymeMix1UL2×1StepBuffer(DyePlus)10L正向引物SRB-SlO-F1uL0.4UM反向弓I物SRB-SlO-R1uL0.4UMTemplateRNA1uL3uLRNaseFreedll20补充反应体积至20LA.4.5.2循环条件设置将A中离心后的PCR管放入PCR仪内，记录样本摆放顺序。循环条件设置：第一阶段，反转录50oC30min；第二阶段，预变性94oC2min；第三阶段，94oC30s,58oC30s,720Clmin,2530个循环;第四阶段:72。C延伸5min。A.4.5.3电泳检测取PCR反应液（约5L）于1%X脂糖凝胶中电泳（120V,0.5XTAE缓冲液体系），电泳（20min30min）后，Gelred染色，在凝胶成像系统中拍照观察。A.5结果判定A.5.1结果分析条件设定根据成像结果，凝胶中根据DNAMarker标识在92ObP的水平位置，如果阳性对照和检测样品均具有扩增条带，而阴性对照、空白对照均不出现该条带，则判断该样品感染南方水稻黑条矮缩病毒；如果阳性对照出现目的条带，而阴性对照、空白对照及检测样品均不出现该条带，该样品判断为未感染南方水稻黑条矮缩病毒。附录B（规范性附录）南方水稻黑条矮缩病品种抗性评价分级标准南方水稻黑条矮缩病品种抗性评价分级标准见表Bl,南方水稻黑条矮缩病病情级别及症状见表B2.B1南方水稻黑条矮缩病抗性评价分级标准抗性级别相对发病率%抗性水平O级O免疫1级0.15高抗3级5.115中抗5级15.130中感7级30.160感病9级>60,1高感B2南方水稻黑条矮缩病病情级别及症状病情级别病株症状0级全株所有分麋均能正常抽X、结实，无明显矮化分藻，感病单株数为0。1级全株1-2个分蕤明显矮化，但全部能结实，颖壳不变色。3级全株1-2个分藤明显矮化，但顶部超过1/3小X能结实。5级全株1-2个分藻明显矮化，顶部有小X结实，但结实率低于1/37级全株1个以上明显矮化、完全不结实分解或出现2个以上结实受影响、颖壳褐变分藻。9级全株一半以上分槃明显矮化或全株矮化。附录C（资料性附录）南方水稻黑条矮缩病品种抗性调查记载表南方水稻黑条矮缩病品种抗性调查记载表见表Cl。表Cl南方水稻黑条矮缩病品种抗性调查记载表播种日期调查日期调查人记载人品种编号品种名称总株数存活株数感病株数感病株率相对发病率病级AlA2A3A4A5A6A78A9感病对照