葡萄糖-6-磷酸Glucose6-phosphate6PG含量测定试剂盒说明书.docx

葡萄糖-6-磷酸（Glucose6-phosphate,6PG）含测定试剂盒说明书微法100管/48样注意I正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定渊定意义：6PG（Glucose-6-phosphate,葡萄糖磷酸，又称6.磷酸葡萄糖），是糖酵解和磷酸戊糖途径的中间产物，广泛存在于动植物体和微生物中。在糖酵解的第一步反应中，葡萄糖被已糖激醉催化生成葡萄糖磷酸，然后通过磷酸葡萄糖异构酶的催化形成果糖-6-磷酸，以继续糖酵解的其它步骤；而在戊糖磷酸途径中，葡萄糖-6.磷酸是其第一个底物，该过程也是生成NADPH的主要途径。此外，葡萄糖-6-磷酸也能转化形成糖原或淀粉而被储存起来。渊定原理：6-磷酸葡萄糖脱氢酶可催化6PG和NADP+生成6磷酸葡萄糖酸和NADPH,NADPH在I-mPMS的作用下使WST-8显橙黄色，在450nm下测定吸光值。需自备的仪器和用品：酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰、蒸储水。试剂的组成和配制：提取液：液体60mLxl瓶，4保存；试剂一：液体12mL×l瓶，4*C保存：试剂二：粉剂Xl瓶，20保存；试剂三：液体L5mLxl管，4C避光保存。6PG提取：1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（IO4个）：提取液体积（mL）为5001000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入ImL提取液），超声波破碎（冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次），8000g,25"C离心Iomin,取上清待测。2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：570的比例（建议称取约0.1g组织，加入ImL提取液），进行冰浴匀浆，8000g,25离心IOmin,取上清待测。3、血清（浆）等液体样品：直接测定。渊定步Ilh1、解标仪预热30min以上，调节波长至450nm02、试剂二的配制：临用前加入3mL水充分溶解待用，用不完的试剂分装后20保存；3、工作液的配制：临用前按照样本数量，按以下比例配制工作液试剂名称（L）测定工作液对照工作液试剂一100I(X)试剂二50水50试剂三10IO4、样本测定按下表在96孔板中加入如下试剂试剂名称(L)测定管对照管样本5050测定工作液150对照工作液15037C避光孵育30min,450nm下测定吸光值A测定与A对照，ZSA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。6PG含计算：1、标准条件下测定回归方程为y=38589x-00016,R2=0.997；X为6PG含量(molmL),y为吸光值。2、按照血清(浆)体积计算6PG含量(nmol/mL)=(A+().(X)16)÷3.8589×VI÷V1×1(XX)=259.1×(A+0.0016)3、按照蛋白浓度计算6PG含量(nmol/mgprot)=(A+0.(X)16)÷3.8589×V1÷(V1×Cpr)×IO(X)=259.1×(A+0.(X)16)÷Cpr4、按照样品质量计算6PG含量(nmolg鲜重)=(A+0.0016)÷3.8589×V1÷(W×V1÷V2)×I(XX)=259.1×(A+0.(X)16)÷W3、按照细菌或细胞密度计算6PG含量(nmol104ceil)=(A+0.0016)÷3.8589×Vl÷(500×Vl÷V2)×IO(X)=0.518×(A+0.16)VI：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1mL：Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g：50()：细菌或细胞总数，500万；】OO0,Umol到nmol的换算系数。