谷胱甘肽S-转移酶glutathioneS-transferaseGST试剂盒说明书.docx

谷胱甘肽S-转移酶（glutathioneS-transferase,GST）试剂盒说明书微量法100T/96S注意B正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。澜定意义：GST是一种具有多种生理功能的蛋白质家族，主要存在于细胞质内。GST是体内解毒酶系统的重要组成部分，主要催化各种化学物质及其代谢产物与GSH的髓基共价结合，使亲电化合物变为亲水物质，易于从胆汁或尿液中排泄，达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此，GST在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外，因为GST具有GSH-PX活性，亦称为nonSeGSH-Px,具有修复氧化破坏的大分子如DNA、蛋白质等的功能。注意，GST催化的反应减少GSH含量，但是不增加GSSG含量。渊定原理：GST催化GSH与CDNB结合，其结合产物的光吸收峰波长为340nm;通过测定34Onm波长处吸光度上升速率，即可计算出GST活性。自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、可调节移液器、紫外分光光度计/醉标仪、微量石英比色皿/96孔板、和蒸储水。试剂组成和配置:试剂一：液体12OmLXl瓶，4保存。试剂二：液体22mLxl瓶，4保存。试剂三：粉剂Xl瓶，42保存。临用前加2mL蒸储水溶解。粗液提取：1 .组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：510的比例（建议称取约0.1g组织，加入ImL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g,4离心IOmin,取上清置冰上待测。2 .细菌、真菌：按照细胞数量（IO4个）：试剂一体积（mL）为5007000：1的比例（建议500万细胞加入ImL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g,4,离心IOmin,取上清置于冰上待测。3 .血清等液体：直接测定。测定：1 .分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到340nm,用蒸储水调零。2 .试剂三放在25（一般物种）或者37七（哺乳动物）保温。3 .测定管：取微量石英比色皿或96孔板，加入20L上清液，180L试剂二和20L试剂三，迅速混匀后于34Onm测定吸光度变化，记录IoS和310s吸光度为AI和A2。GST活性计算公式：a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下（1） .按蛋白浓度计算活性单位定义：在25或者37C中，每亳克蛋白每分钟催化InmolZLCDNB与GSH结合为1个防活单位。GST(nmol/min/mgprol)=(A2-Al)÷c÷dl()9V反总÷(CprxV样)÷T=230×(A2-Al)÷Cpr（2） .按样本质量计算活性单位定义：在25或者37aC中，每克样品每分钟催化InmolZLCDNB与GSH结合为1个酶活单位。GST(nmol/min/g鲜重)=(A2-A>c÷dl()9V反总÷(WxV样÷V样总)÷T=23O×(A2-A1)÷W(3)按细胞数量计算活性单位定义：在25或者37中，每IO。个细胞每分钟催化InmolflLCDNB与GSH结合为1个酶活单位。GST(nmolmin104cell)=(A2-Al)÷c+dl()9V反总÷(细胞数量XV样÷V样总)÷T=230x(A2-Al)÷细胞数量(4)按液体体枳计算活性单位定义：在25或者37T中，每本升液体每分钟催化InmolZLCDNB与GSH结合为1个麻活单位。GST(nmol/min/mL)=(A2Al)÷÷dl09v反总+v样÷T=23O×(A2-A1):产物摩尔消光系数，9.6×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；106:ImoI=IXlo6mol;V反总：反应体系总体积，220L=22xl0L;Cpr：上清液蛋白质浓度(mgmL),需要另外测定，建议选用本公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20L=002mL；V样总：提取液体积，1mL：T：反应时间(min),5min0b.使用96孔板测定的计算公式如下(1) .按蛋白浓度计算活性单位定义：在25或者371C中，每亳克蛋白每分钟催化InmolZLCDNB与GSH结合为1个防活单位。GST(nmol/min/mgprot)=(A2-Al)÷c+dl()9V反总÷(CprxV样)÷T=460×(A2-AI)÷Cpr(2) .按样本质量计算活性单位定义：在25或者37中，每克样品每分钟催化InmolZLCDNB与GSH结合为1个衡活单位。GST(nmol/min/g鲜重)=(A2-Al)÷>dl()9v反总÷(WxV样÷V样总)÷T=46O×(A2-A1)÷W(3)按细胞数量计算活性单位定义：在25tC或者37°C中，每IO。个细胞每分钟催化InmolZLCDNB与GSH结合为1个醉活单位。GST(nmolmin104cell)=(A2-A>g÷dl()9V反总÷(细胞数量XV样÷V样总)÷T=460x(A2-Al)÷细胞数量(4)按液体体积计算活性单位定义：在25或者37C中，每亮升液体每分钟催化lnmolLCDNB与GSH结合为1个麻活单位。GST(nmol/min/mL)=(A2Al)÷÷dl()9v反总v样÷T=46O×(A2-A1)e：产物摩尔消光系数，9.6×103LZmol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；106:Imol=I×106mol;V反总:反应体系总体积，220L=22xllL;Cpr：上清液蛋白质浓度(mgmL),需要另外测定，建议选用本公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20L=0.02mL；样总：提取液体积，1mL：T：反应时间（min）,5min（）注意事项：1 .样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；2 .细胞中GST活性测定时，细胞数目须在300万500万之间，细胞中GST的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞；3 .本法测定GST活性的线性范围可达76molminL,测定前先用12个样做预实验，如5min内反应不成线性，须对样品用蒸储水稀释，计算结果乘以稀释倍数；4,测定反映的温度对测定结果有影响，请控制在25°C或者37tC（哺乳动物