脱氢酶dehydrogenase,DHA试剂盒说明书.docx

脱氢酶（dehydrogenase,DHA）试剂盒说明书微量法100管用6样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定.测定意义：脱氢函（dehydrOgenaSe,DHA）是一类催化物质氧化还原反应的酶，催化底物通过细胞色素系统被氧化，释放的能量供机体使用，是生物体取得能量的一种方式。测定原理：在细胞呼吸过程中，氢受体2,3,5-氯化三苯基四氮哩（2,3,5-TriphenylTetrazoliumChloride,TTO在脱氢酶作用卜接受氢以后，被还原为三苯基甲猫（TriPhenylFOrmaZOne,TF）,TF呈现红色，于485nm测定其吸光值，即得脱氢酶活性。自备实验仪器及用品：筛子、天平、恒温培养箱或水浴锅、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿用6孔板、冰、蒸储水、甲醇（不允许快递，请用户自备）。试剂的组成和配制：提取液：液体100mLXl瓶，4匕保存试剂一：粉剂1瓶，使用前加10mL试剂二溶解，4°C避光保存（尽量现配现用）。试剂二:液体20mll瓶，4保存。试剂三：甲醇，自备。样品处理：1 .细菌、真菌：按照细胞数量（IO4个）：提取液体积（mL）为50010:1的比例（建议500万细胞加入ImL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min）：然后8000g,4,离心IOmin,取上清置于冰上待测。2 .组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：510的比例（建议称取约Slg组织，加入Iml提取液）进行冰浴匀浆，然后8000g,4*C,离心20min.3 .液体：直接检测。测定步骤和操作表:空白管测定管样品（UL）100蒸馀水（UL）100试剂一（uD100试剂二（D100充分混匀，37C培养24h试剂三（L）900900振荡lh,8000g.25,离心5min,取200L上清于微量石英比色皿出6孔板，测定A485,ZXA=A测定-A空白管。空白管只要做一管。脱氢酶活力计算：a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线:y=0.0422x-0.0312；R2=0.9988：X为标准品浓度(gmL),y为吸光值。1.按照蛋白浓度计算酶活单位定义：在37时，每mg蛋白样品每min催化产生IHgTF为一个酶活性单位。DHA(gminmgprot)=(A+0.0312)÷0.0422V反总÷(CPrXV样)÷T=0.181x(A+0.0312)÷Cpr2.按照样本质量计算酶活单位定义：在37时，每克样品每min催化产生IUgTF为一个酶活性单位。DHA(gmin/g鲜重)=(A+0.0312)÷0.0422xV反总÷(WXV样÷V样总)÷T=0.181×(A+0.0312)÷W3.按液体体积计算酶活单位定义：在37时，每mL样本每min催化产生IUgTF为一个酶活性单位。DHA(gminmL)=(A+0.0312)÷0.0422xV反总÷V样÷T=0.181X(A+O.O312)V反总：反应总体积，1.1mL：V样：加入反应体系中样本体积，0.1mL：T：培养时间，Id=I44Omin：W：样品质量,g;Cpr：蛋白浓度，mg/mLob.用96孔板测定的计算公式如下标准曲线：y=0.0211x-0.0312；R2=0.9988：X为标准品浓度(gmL),y为吸光值。1.按照蛋白浓度计算酶活单位定义：在37时，每mg蛋白样品每min催化产生IUgTF为一个酶活性单位。DHA(gmin/mgprot)=(A+0.0312)+0.021IXV反总÷(CPrXV样)÷T=0.362×(A+0.0312)÷Cpr2.按照样本质量计算酶活单位定义：在37时，每克样品每min催化产生1gTF为一个酶活性单位。DHA(gmin/g鲜重)=(A+0.0312)+0.021IXV反总÷(WXV样÷V样总)÷T=0.362×(A+0.0312)÷W3.按液体体积计算酶活单位定义：在37时，每mL样本每min催化产生IUgTF为一个醉活性单位。DHA(gminmL)=(A+0.0312)÷0.021：LXV反总÷V样÷T=0.362(A+0.0312)V反总：反应总体积，1.1mL：V样：加入反应体系中样本体积，0.1mL：T：培养时间，Id=I44Omin：W：样品质量，g;Cpr：蛋白浓度，mgmL注意事项：配制好的试剂一避光保存于4,最好在一周内使用，若出现红色，则不能使用。