谷胱甘肽还原酶GR活性测定试剂盒说明书.docx
谷胱甘肽还原酶（GR）活性测定试剂盒说明书微量法100T/96S注意：正式测定之前选择23个预期差异大的样本做预测定。渊定意义：GR是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一（通常昆虫中GR被TrXR取代）。GR催化NADPH还原GSSG生成GSH,有助于维持体内GSH/GSSG比值。GR在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外GR还参与抗坏血酸一谷胱甘肽循环途径。漏定原理：GR能催化NADPH还原GSSG再生GSH,同时NADPH脱氢生成NADP*;NADPH在340nm有特征吸收峰，相反NADP+在该波长无吸收峰；通过测定340nm吸光度下降速率来测定NADPH脱氢速率，从而计算GR活性。自备仪器和用品：低温离心机、水浴锅、移液器、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、和蒸镯水试剂组成和配置：试剂一：液体12OmLXl瓶，4C保存。试剂二：粉剂x2支，-20C保存。临用前加入1.2mL蒸溜水，混匀。试剂三：粉剂x2支，-20C保存。临用前加入0.6mL蒸惚水,混匀。粗液提取：1 .组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1：510的比例（建议称取约0.1g组织，加入ImL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g,4离心15min,取上清，置冰上待测。2 .细菌、真菌：按照细胞数量CO4个）：试剂一体积（mL）为500100S1的比例（建议500万细胞加入ImL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g,4,离心I5min,取上清置于冰上待测。3 .血清等液体：直接测定。操作步骤：1 .分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到340nm,蒸储水调零。2 .试剂一置于25（普通物质）或者37（哺乳动物）中预热30min.3 .测定管：取微量石英比色皿或96孔板，依次加入10L试剂三，20L试剂二，150L试剂一，20L上清液，混匀，于340nm迅速测定初始吸光度和180S吸光度，记为A测1和A测2,A测定管=A测1-A测2.注意:1 .加完上清液后必须迅速混匀测定，保证准确测出初始反应速度；2 .当出现初始180s内吸光值不稳定时，可以适当延长反应时间，选取相对稳定的时间段内吸光值变化值；3 .当所测AA测定管的值在零点附近徘徊时，可能原因：(1)样本GRiW活性低，建议浓缩样本后再进行测定；(2)样本GR酶活性过高，吸光值变化区间过小无法准确测出，建议样本稀释25倍后再进行测定)计算公式：a.使用微石英比色皿测定的计算公式如下(1) .按蛋白浓度计算活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每亳克蛋白每分钟催化InmolNADPH氧化为1个酶活单位。GR除活(nmol/min/mgprot)=A测定管÷c÷d*V反总x104CprxV样÷T=536xZkA测定管÷Cpr(2) .按样本质量计算活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每克样本每分钟催化InmOlNADPH氧化为1个酶活单位。GR醒活(nmol/min/g鲜重)=ZkA测定管÷g÷dxV反总xl()9÷(WxV样÷V样总)÷T=536×A测定管÷W(3)按细胞数量计算活性单位定义：在一定温度中，pH80条件下，每IO"个细胞每分钟催化InmoINADPH氧化为1个酶活单位。GRfii(nmolmin104cell)=A测定管FdXV反总xlO,÷(细胞数量XV样÷V样总)=536xAA测定管÷细胞数量(4)按液体体积计算活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每亳升液体每分钟催化InmolNADPH氧化为1个酶活单位。GR醒活(nmol/min/mL)=A测定管÷dxV反总xl4÷v样÷T=536xA测定管:NADPH摩尔消光系数6.22X103Lmolcm;d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，200L=2×104L;IO6：1mol=l×106mohCpr：上清液蛋白浓度(mg/mL)；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20L=2x102mL;V样总：提取液体积，1mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，3min。b.使用96孔板测定的计算公式如下(1) .按蛋白浓度计算活性单位定义：在定温度中，pH8.0条件下，每毫克蛋白每分钟催化InmolNADPH氧化为1个酶活单位。GR醉活(nmol/min/mgpro。=A测定管十+dV反总xlO,YCPrXV样÷T=1072xA测定管÷Cpr(2) .按样本质量计算活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每克样本每分钟催化InmOlNADPH氧化为1个酶活单位。GR醒酒(nmol/min/g鲜重)=2A测定管÷dxV反总xl÷(WxV样÷V样总)÷T=1072×A测定管÷W(3)按细胞数量计算活性单位定义：在一定温度中，pH80条件下，每KT个细胞每分钟催化gm。1NADPH氧化为1个酶活单位。GR施活(nmolmin104cell)=A测定管+÷dV反总xlO,M细胞数量XV样÷V样总)=1072×A测定管÷细胞数量(4)按液体体积计算活性单位定义：在一定温度中，pH8.0条件下，每亳升液体每分钟催化InmolNADPH氧化为1个酶活单位。GR布活(nmol/min/mL)=(A测定管-AA空白管)÷÷dV反总x09XV样÷T=1072×A测定管£：NADPH摩尔消光系数6.22X103L/mol/cm：d：96孔板光径,05cm；V反总:反应体系总体积,200L=2x1(T41.：IO6：1mol=1×106mohCpr：上清液蛋白浓度(mg/mL)：W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积，20L=2102mL;V样总：提取液体积，1mL：V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间，3min。注意事项：(1)样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定所活力，匀浆液避免反复冻融；(2)试剂二和试剂三须现配现用，配制完后，置于冰上，未使用完的4C保存，三天内使用完。(3)测定前须先用12个样做预实验，哺乳动物组织一般须用试剂一稀释25倍。(4)细胞中GR活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GR的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。
