还原型抗坏血酸ascorbicacidAsA含量测定试剂盒说明书.docx

还原型抗坏血酸（ascorbicacid,AsA）含测定试剂盒说明书微法IoOT/96S注意I正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定.测定意义：ASA又称维生素C。ASA是辅酶、自由基清除剂、电子共体，受体和草酸盐与酒石酸盐生物合成的底物等。作为植物细胞中最重要的抗氧化剂，ASA在保护叶绿体免于氧化损伤起着举足轻再的作用，也是衡量农作物产品品质的重要指标之一.刑定原理I在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐B反应生成黄色的草酰册-2-羟基酰内酯衍生物，在最大吸收波长420处测定吸光度。自备仪器和用品：研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液器和蒸谣水.试剂组成和配制：提取液：液体IoomLXl瓶，4dC保存。试剂一：液体4mLxl瓶，4匕保存。试剂二：液体6mLl瓶，4七保存。试剂三：粉剂x2瓶（棕色），4.C避光保存。临用前配制，每瓶加入7mL蒸情水充分溶解，用不完的试剂4匕下可保存3天.样品中ASA提取：1 .组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1：510的比例（建议称取约0.1g组织，加入ImL提取液）进行冰浴匀浆。8000g.4C离心20min,取上清置冰上待测。2 .细菌、真菌：按照细胞数量（IO4个）：提取液体积（mL）为500ToOO：1的比例（建议500万细胞加入ImL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min）;8（）00g,4V离心20min.取上清液置冰上混匀待测。3 .血清等液体：直接测定.ASA浦定操作：1.分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到420nm,蒸慎水调零。2.在EP管中加入卜,列试剂试剂名称（L）测定管空白管样本10()提取液100试剂一3030试剂二5050试剂三120120水700700混匀，25t静置20min,吸取200L加入微量石英比色皿/96孔板中，420Rm下测定各管吸光值&AA=A测定-A空白。注意：标准管只需测定一次。AsA含计算公式：2使用微量石英比色皿测定的计算公式如下标准曲线y=O.(X)88x-O.OI8,R2=0.9978(1) .按蛋白浓度计算AsA(座mgprot)=(AOI8)÷W88xV样÷(CprxV样)=1l3.63(A÷0.01S)÷Cpr(2) .按样本质量计算AsA(g,鲜重)=(A+0.018)÷0.0088xV样MWxV样÷V样总)=H3.63(A+0.018)÷W(3) .按细胞数量计算AsA(g'10,cell)=(A+0.()18)÷0.(K88xV样÷(细胞数量XV样=V样总)=11363x(AA+O.018)÷细胞数量<4)按液体体积计算AsA(g,mL)三(A+0.018)÷0.(X)88=113.63×(A÷0.018)V样：加入样品体积，0.1mL：V样总：加入提取液体积，LOinL;Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量(g)oE使用96孔板测定的计算公式如下标准曲线y=0.0044-OOIfi,R2=0.9978(D按蛋白浓度计算AsA(gj,ngprot)=(AA+0.018)-?0IX)44xV样÷<CprxV样)=227.27×(A+O.O18)÷Cpr(2) .按样本质量计算AsA(g鲜重)=(A+0.018)÷0.()044xV样HWMV样÷V样总)=227.27×(A+0.018)÷W(3) .按细胞数量计算AsA(gIO1cell)=(A+01)18)÷0X)044xV样÷(细胞数量MV样÷V样总)=227,27SA+OQl8)÷细胞数量<4)按液体体积计算AsA(gL)=(A+0.018)÷0.0044=227.27×(A+O.O18)V样：加入样品体积*OJmL;V样总：加入提取液体积，LOmL;Cpr：上清液蛋白质浓度.mg/mL:W：样品质量(g)o注意事项：试剂三现配现用，配制好的4C保存，3天内使用完。