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2023外泌体在卵母细胞发育及相关疾病中的研究进展摘要外泌体是源自细胞膜系统的囊泡，起源于内体多囊泡体，释放到组织液中。外泌体作为细胞间通信的载体，含有蛋白质、脂质、源自其供体细胞质的编码或非编码RNAe卵泡是卵母细胞发育的重要微环境，在卵母细胞发育过程中，物质通过细胞外囊泡进行卵母细胞与卵泡周围卵丘和颗粒细胞之间的物质传递，从而调节卵母细胞的基因表达。在正常和病理条件下，外泌体由多种细胞释放，参与多种疾病的发生发展，可作为疾病的候选生物标志物及治疗干预的潜在目标。本文阐述了外泌体中的微小RNA、长链非编码RNA及环状RNA等成分在卵母细胞发育状态中的作用机制及其在卵巢、子宫相关生殖系统疾病如多囊卵巢综合征、卵巢癌、子宫内膜异位症中的变化。针对外泌体的检测可以深入了解卵母细胞发育状态，有助于疾病的预防、诊断和治疗。卵泡是卵母细胞发育的重要微环境。卵泡由体细胞组成，内含卵母细胞、膜细胞、颗粒细胞和卵丘细胞1L卵巢中的原始卵泡经过募集、选择和优势化等过程,逐步发育为初级卵泡、次级卵泡、有腔卵泡和成熟卵泡2JO卵泡受到卵泡刺激素、黄体生成素、促性腺激素释放激素信号通路、成纤维细胞生长因子信号通路、凋亡和自噬信号等通路的调控3-4,卵泡形态和功能发生周期性的变化，主要包括卵泡腔的形成、扩张和卵泡液的积累，从而形成成熟的卵母细胞。外泌体作为载体参与多种生理过程，包括细胞增殖、分化、配子发生、胚胎发生和发育的调节。外泌体携带的物质在卵泡发育中发挥着重要的作用,如微小RNA(microRNA,miRNA)会影响原始卵泡的形成和发育4L影响卵母细胞发育和卵泡优势化5,伴随卵泡发育及卵母细胞生长，参与受精和胚胎发育61卵泡微环境内的细胞间通信参与卵母细胞生长和发育成熟的调节过程，外泌体作为细胞间信息传递的桥梁，了解其中内含物，有利于进一步分析和研究卵泡发育及卵母细胞的成熟机制。-卵泡液卵泡液是一种复杂的、半黏性的细胞外液，随着卵泡的生长而积聚在窦卵泡中。卵泡液来源于流经卵泡膜毛细血管的血液，这些流经的血液为卵泡液提供相关成分，有助于卵母细胞的生长70卵泡液由卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞分泌和卵泡膜血管渗出液组成,是卵母细胞与周围细胞之间双向通信的媒介,其主要成分为蛋白质、类固醇激素、多糖和代谢物等70卵泡液为卵母细胞成熟提供了重要的微环境，卵泡液中存在诱导细胞成熟的重要调节因子，通过细胞间的通信为卵母细胞提供营养。卵泡液为促进优势卵泡成熟提供独特条件8,卵泡液成分的改变可以反映病理状态下卵泡细胞的分泌过程和血浆组分的变化。卵泡液成分与卵母细胞的代谢活动有关，反映卵泡的生理状态，因此对于卵泡液成分的分析可以提供卵母细胞质量及卵泡分化和发育途径的有用信息。二细胞外囊泡的特点细胞外囊泡是细胞间通信的重要媒介，协助进行蛋白质、mRNA、m很NA和脂质等物质的运输，根据囊泡大小和来源分为三类，包括外泌体、微泡和凋亡小体9,其中，外泌体是内吞来源的小膜囊泡(直径在50-90nm),在多泡体与质膜融合时释放到细胞外环境中10外泌体由多种活细胞分泌，来源于不同组织的外泌体具有其组织特异性蛋白。外泌体广泛存在于不同的生物体液内，如血液、尿液、唾液、母乳、卵泡液、宫腔液和阴道液等，具有良好的稳定性。2012年daSilveira等11的研究显示，在马的卵泡液中存在含有miRNA和蛋白的外泌体，由此开始了外泌体在卵泡发育中的研究。在卵巢内，颗粒细胞排列在卵泡周围，并与卵丘-卵母细胞复合体(cumulus-oocytecomplex,COC)进行物质交换。已有文献证明卵泡液外泌体可诱导COC扩张，使卵母细胞经历完全的减数分裂成熟12另有研究表明人类来源的卵泡液外泌体中含有与抑制滤泡成熟和恢复减数分裂相关的靶基因miRNAs,包括miR-132、miR-212和miR-21413,同时卵泡液外泌体通过CNP-NPR2信号通路抑制卵母细胞减数分裂成熟14这些外泌体介导的作用差异可能是由于在月经周期的不同时间卵泡液外泌体内容物的变化造成，在月经周期的不同阶段，外泌体内容物的显著变化表明卵泡液外泌体是卵泡发育的动态参与者15o卵泡液中存在丰富的外泌体，通过蛋白质组学分析，已经确定了数百种蛋白质存在于外泌体中，这些蛋白质和RNA折叠、分子运输和信号转导有关，在卵母细胞发育潜能和卵泡稳态中发挥重要作用16J5同时外泌体miRNAs参与多种肿瘤的发生发展，如血管生成转移，这提示外泌体具有成为肿瘤辅助诊断的生物标志物的潜力。血浆外泌体源性miR-452-5p在胃癌患者中表达显著增加17,心力衰竭患者血清外泌体中p53途径相关的miRNA表达量明显升高18,因此通过检测体液中外泌体的表达水平，可进行疾病的早期诊断，有望成为液体活检领域的另一研究方向。三外泌体在卵母细胞发育中的变化及作用卵泡中的卵母细胞与卵丘细胞、颗粒细胞和卵泡膜细胞有着密切联系。外泌体作为细胞间通信的重要媒介，通过旁分泌、自分泌和内分泌信号因子作用，促进卵母细胞发育成熟和启动减数分裂190外泌体含有特定的miRNA、长链非编码RNA(longnon-codingRNA,IncRNA)和环状RNA(circularRNA,circRNA),在卵母细胞生长过程中，参与协调细胞间联系，影响卵母细胞成熟以及排卵20-210以下将分别探讨miRNA、InCRNA、CirCRNA在卵母细胞发育中的作用。1.miRNA:miRNA是小的非编码RNA,通过靶向特定mRNA调控基因表达，在转录后调控中发挥重要作用。外泌体携带的miRNA被认为靶向哺乳动物卵泡生长和卵母细胞成熟相关通路中的关键分子，miRNA通过以下通路来参与卵母细胞的发育。(1)Wnt信号通路：Wnt信号通路通常分为B-Catenin依赖的经典通路和非经典通路，小鼠体内Wnt4的失活会导致部分雌性向雄性的性别转换和卵母细胞消耗。转基因小鼠的研究表明，卵泡生成、黄体生成和类固醇生成需要Wnt4、Fzd4和Ctnnbl这3个Wnt通路的组成部分，同时Wnt信号通路的异常调控可导致颗粒细胞肿瘤的发生22Je(2)转化生长因子(transforminggrowthfactor,TGF)-B通路:TGF-超家族成员包括抑制素、激活素、骨形态发生蛋白15(bonemorphogeneticprotein15,BMP15)和生长分化因子9(growthdifferentiationfactor9,GDF9)等，这些配体通过细胞表面受体和细胞内Smad信号转导蛋白传递信号。受体激活后，Smad蛋白的两个竣基末端丝氨酸残基被磷酸化，转移至细胞核内以调节基因表达23,从而调控卵泡生长和卵母细胞成熟。(3避裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)途径:MAPK级联是调节多种细胞过程的关键信号通路,包括增殖、分化、凋亡和应激反应。MAPK途径包括三种主要激酶，MAPK激酶的激酶(MAPKkinasekinase,MKKK<MAPK激酶(MAPKkinase,MKK)和MAPK24,在卵母细胞发育上，MAPK通路刺激颗粒细胞增殖和卵丘扩张。此外，MAPK通路与ERBB通路一起，促进卵母细胞减数分裂的恢复251(4)泛素介导的途径：泛素蛋白酶体系统是高度保守的信号通路，严格调节细胞中的蛋白质运转，泛素介导的通路调节卵母细胞减数分裂的成熟和胚胎早期有丝分裂26L人类卵泡液外泌体的miRNA与卵母细胞的成熟和质量有关,有研究表明,hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-4271、hsa-miR-3148、hsa-miR-3646和hsa-miR-4481参与调控MAPK信号通路中16个基因的表达洞时hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-4271和hsa-miR-3148调控18个参与卵母细胞减数分裂的基因，其中hsa-miR-15b-5p与MAPK信号通路和卵母细胞减数分裂途径的相关性最高270miR-181a、miR-375和miR-513a-3p这三种miRNA均靶向调节TGF-B信号通路，抑制TGF-B途径，导致老年女性卵母细胞成熟障碉280miR-29a、miR-99a、miR-100xmiR-132、miR-212、miR-214xmiR-218、miR-508-3p和miR-654-3p通过黄体生成素和卵泡刺激素诱导激活蛋白激酶B(proteinkinaseB,PKB/AKT)和MAPK信号通路,从而启动减数分裂20,28多个不同的miRNA可以作用于相同的mRNAmiR-132miR-212和miR-214都能够调节PTEN蛋白,单个miRNA可以靶向不同的mRNA,如miR-132能够调节张力蛋白同源物(phosphataseandtensinhomologdeletedonchromosometen,PTEN1RB1和DNMT3A201除了Wnt信号通路、TGF-雎号通路、MAPK信号通路，p53通路在衰老过程中起着重要的作用。研究报道miR-134在老年女性中高表达，miR-134靶向细胞凋亡抑制剂BCL2和IKBKG蛋白，导致BCL2和IKBKG的表达量降低，人卵巢颗粒细胞的凋亡29DNA甲基化可以动态监控卵母细胞的生长，由m很-29a和m很-132介导的DNMT3沉默可以解释在植入前胚胎和内细胞团中发现的低甲基化30-311详见表1。表I与卵泡发育相关的信（通跻及对应的miK信8通略作川相关IniRNA#专支1Wnl卵泡生氏、黄体生成和先固岬生成的情击"28,32TGFf仇近卵泡生长和卵修细胞成熟iniH-ISIA.miR>375,miK-513ia-3>.ltnill-95t,la-m-297,lM-iH-625Imi-miK-60228.33MAPK刺来诵也瓶附增殖和卵死。张.LjERRB通癌一起促道卵仅细整减数分裂的恢复la-niR*15b>5p.lM*aiR945p,hM*miR4271.hn»-miR«3l48,h>-mil<-646a-m-44HI25,27-28泛素介导的注校祠NSH从加也破故分S!的成熟m胚舱的¥期有段分裂28仲"昔希击自信号通略祠节卿T发学和en泡的影成128,3423可能3与人置0副、的Iih.禽枪miK-2l-5p.mH-13429注Oi中人岁WW体的相关NHNA:TGr平示H化生长因子MANK示被裂原活化能门制hmiK、A示微小K"2.IncRNA和CirCRNA:已有研究报道InCRNA参与调节染色质修饰、基因转录、mRNA翻译和蛋白质生成35o人类基因组包含约9000个IncRNA基因座，编码约15000个转录本，在剪接和转录后加工方面，InCRNA与蛋白质编码基因协同作用36olncRNA-p21是人宫颈癌HeLa细胞中高度富集的分子，其次是CCNDl-InCRNA和HoTAIR。外泌体中的TUG1和GAS5水平适度升高，而MALAT1水平与其细胞水平相当。lncRNA-p21在外泌体中高度富集,在p53依赖性转录反应中充当阻遏物抑制目标mRNA翻译21,其表达水平的变化影响宿主细胞基因调控,从而影响卵母细胞发育。CircRNA是区别于传统线性RNA的一类新型RNA分子,是具有独特的闭合环状结构的单链RNA,大部分的CircRNA仅由少量外显子序列构成，在不同的物种中具有高度的保守性，同时存在组织和发育阶段的表达特异性。CircRNA因其环化结构具有较高的稳定性，在各种组织和体液中含量丰富。研究表明CirCRNA可能参与精子发生、受精、生殖干细胞的分化调控、性别决定、胚胎发育阶段的调控37L大多数CircRNA与相关mRNA前体之比约为10%,但PRDM2、SETD2、MLLT3等基因转录的CircRNA表达量超过其相关mRNA前体，这些亲本基因主要与组蛋白甲基化、转录调节等功能相关380因此，外泌体中的CircRNA可能参与卵母细胞的组蛋白甲基化，调控卵母细胞的生长。四外泌体在生殖系统疾病中的变化1.多囊卵巢综合征(polycysticovarysyndrome,PCOS):PCOS是以稀发排卵或无排卵、高雄激素或胰岛素抵抗、多囊卵巢为特征的内分泌紊乱症候群，PCOS患者因持续无排卵，导致子宫内膜过度增生，增加子宫内膜癌的发生风险，检测PCOS患者外泌体中的miRNA,IncRNA的变化有助于了解卵母细胞发育的异常机制帮助疾病早期诊断。CUi镣27研究在PCOS患者卵泡液中观察到101个特异的外泌体相关miRNA,这些卵泡液外泌体miRNA在PCoS患者与非PCC)S患者间存在表达差异。Scalici等39研究显示PCOS患者卵泡液中的let-7b和miR-140显著下调，而miR-30a显著增加。Yin等40研究表明，PCOS患者中miR-320表达上调，miR-320的过表达通过E2F1/SF-1抑制雌激素的产生，这可能是造成PCOS患者高雄激素血症的原因。HU等41研究确定了6种可能与PCOS发病机制相关的miRNA(miR-6087、miR-199a-5p、miR-143-3p、miR-483-5p、miR-23b-3p和miR-200a-3p),这些miRNA主要调控与氨基酸生物合成、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、糖胺聚糖生物合成、单竣酸代谢和碳代谢有关的信号通路。PCOS患者血清外泌体中miR-27a-5p的表达升高，mR-27a-5p靶向SMAD4蛋白，调控TGF-信号通路，促进子宫内膜癌细胞的迁移和侵袭421刘琳等43通过测序观察到外泌体中差异IncRNA在卵母细胞减数分裂、胰岛素信号通路、胰岛素抵抗、胰岛素分泌、1型糖尿病、2型糖尿病、雌激素信号等通路富集推测差异IncRNAs可能参与PCOS的发生发展。Zhang窜44F开究表明lncCD36-005在PCOS大鼠模型子宫内高表达，促进大鼠原代子宫内膜间质细胞增殖,在CD36-005过表达的基质细胞中，共鉴定出55种差异表达的mRNAoLiu等45研究显示颗粒细胞ncHCG26在PCOS患者中表达上调，并且与卵巢中的窦卵泡和卵母细胞数量有关。HCG26敲除导致KGN细胞中细胞活力降彳昭口细胞周期抑制，增加芳香酶表达和雌二醇产生，并与窦卵泡计数相关，表明HCG26在PCOS进展中发挥重要作用4601.iang等21通过生物信息学分析显示PCOS患者中存在与炎症相关通路和氧化应激相关的245个下调和167个上调的CircRNA0研究报道，circ-0006877在PCOS患者卵泡液外泌体中具有差异表达47-48,circ-0006877是由低密度脂蛋白受体基因加工而来，circ-0006877的低表达同时伴随miR-1294的较高表达和细胞色素P450家族19亚家族A成员1(cytochromeP450family19subfamilyAmember1,CYP19A1)的低表达，circ0006877miR-1294CYP19A1通过竞争性内源RNA(competingendogenousRNA,ceRNA)网络控制PCOS患者卵巢类固醇生成相关通路多种CircRNA在PCOS患者卵泡液中呈异常表达，差异CirCRNA可能通过细菌感染、氧化应激、自噬、神经系统病变等病理过程导致PCOS发生，circRNA-7323-TIAMIscircRNA-2003-BECNI、circRNA-1880-RHOA、circRNA-10775-RUVBLI这4种差异表达的CircRNA可作为PCOS发病相关机理的目标靶点490Li等50的研究表明S100-A9蛋白在PCOS患者外泌体中上调，富含S100-A9的外泌体可以显著上调KGN细胞系中促炎因子和趋化因子的表达，促进核因子(nuclearfactor,NF)-kB通路激活同时NF-kB通路的特异性抑制剂BAY-117082阻断S100-A9诱导的炎症表达。外泌体中富集的S100-A9蛋白通过NF-B通路，导致CYP17mRNA的异常表达，干扰类固醇生成。2.卵巢癌:卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,卵巢癌患病早期症状不明显,不易被发现。外泌体中的物质在卵巢癌疾病进展中存在变化，通过对卵巢癌患者的外泌体检测可以辅助诊断卵巢癌的发生发展。YOShimUra窜51通过外泌体微阵列芯片，观察到miR-99a-5p在卵巢癌患者血清中表达明显升高，是良性肿瘤患者的1.7倍和健康志愿者的2.8倍。来自上皮性卵巢癌细胞的外泌体miR-99a-5p通过上调纤连蛋白和镜连蛋白影响人腹膜间皮细胞，促进细胞侵袭。外泌体miR-99a-5p诊断卵巢癌的特异度为0.75,灵敏度为0.85,说明miR-99a-5p可作为早期诊断卵巢癌的潜在生物标志物。卵巢癌细胞外泌体高表达RNA结合蛋白(RNA结合蛋白LIN28)可以促进上皮间质U专变52,RNA结合蛋白LIN28是干细胞的已知标志物，当它在癌症中表达时，与肿瘤预后不良相关。LIN28高表达的卵巢癌细胞分泌的外泌体可以被非肿瘤细胞吸收，并引起与肿瘤发展相关的基因表达和细胞行为的改变.卵巢癌细胞通过外泌体传递分化抗原44(clusterofdifferentiation44,CD44)至间质细胞，引起基质金属蛋白酶9分泌增加，促使卵巢癌进展及转移的肿瘤微环境形成，促进卵巢癌进展53来自脂肪间充质干细胞的外泌体可以通过阻断细胞周期和激活线粒体介导的凋亡信号抑制A2780,使人卵巢癌细胞增殖异常，提示外泌体miRNA在这一抑制途径中的重要性，为卵巢癌的研究和治疗提供新的进展54o在IncRNA的研究中显示卵巢癌患者外泌体在数量和蛋白含量上与正常人群存在显著差异，提示IncRNA参与卵巢癌细胞的增殖和分化I5513.子宫内膜异位症：子宫内膜异位症是一种慢性妇科疾病，其特征是子宫外的子宫内膜组织发育，主要生长于女性骨盆内脏和腹膜表面，子宫内膜异位症常伴有慢性盆腔疼痛和不孕症。研究表明，外泌体中的miR-22-3pmiR-320a通过PI3KAkt通路参与调节细胞增殖，造成子宫内膜异位症的病理改变56om很NA微阵列分析显示miR-196b在人类子宫内膜异位囊肿基质细胞(endometrialcancerstemcell,ECSC)中下调57,miR-196b抑制ECSCs增殖和诱导凋亡，降低c-myc和Bcl-2mRNA表达。同时ECSCs中miR-196b基因高甲基化，用DNA去甲基化剂处理可以恢复ECSCs中miR-196b的表达。WU等58研究显示miR-214在异位子宫内膜间质细胞(ectopic-endometrialstromalcell,Ecto-ESC)中表达,通过外泌体转运将miR-214递送至Ecto-ESC细胞，导致内源性结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF)和胶原蛋白Od的mRNA表达降低，参与子宫内膜异位症患者组织纤维化的改变。外泌体在相关生殖系统疾病中的变化及作用汇总见表2衰2外泌体住相关系统疾编中的变化及作用疾%表达变化及作川叁多义©、IIttiR-320寿增加39mfSf,'?,99'5pmi',43'3p"K-4O5p">iK-23b-3p“IniN2O3>溺控*路生要"也*敏°物介41)IniR27.5p博#r宫内IR崛裕总系的迁移和侵我42InrN、A的GUvDKE(；C/号胎汁卵"用IllK致分裂&强更作用(44!MN、AHCC26住PCOS也先中人达上m.并H叮室卵泡it数和嘎出的却以拙舱!故收有关431hMarirr906877-miK294aPI9Al的吏争性内力KNA网络控制PCUS相关通路.伪M/*莫阂解小成471riKNA732"11MImH2(WMHE(N.cKAIKxaKMM,sK、AIO775IU、HUii4H*邦洋我达的49<inKXA可能作为-一步研究英机理的目标纪点SIOQ-9SfHCHIWS.也外浊体中卜JW.外泌体富集的S1(M9击门通过、F-KU通路.导蚀G，17mH、A的；50；异常衣达.从而扰类INirl成卵酬后HK-9-5l>件卵m密患界中WIa升高51卵职度细板外泌体R&达HNA结介击白(收加人K、A站台2K门28)S2外沔体传递Clm不同皮掴也.引起晓欢金禺击门看9分泌增加.形成BMSie环境531外泌体阻断也胞周Vl和激活税粒体介导的凋亡信号抑制A278O人麻*嘛缘IIftPff哝154J宫内膜异位比miR-22-3p,miR-32(taM以通过PI3KMh通跆苗:阳节编跑的培砧56miR2l4fW纤堆化抑制作用.能彰0靖缗出织生长因子的表达3811!WS小多*W*粽令证；M小枝因f;ClM4示分化杭讨44五.总结外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通信，外泌体在许多生物合成过程中发挥至关重要的作用，其携带的RNA和蛋白质含量可反映其来源细胞的表达水平。现如今对外泌体的研究兴趣日益增长，对于外泌体的研究不仅有助于理解卵母细胞与卵泡微环境之间的信号转导、相互作用机制，同时对于疾病的早期诊断和治疗至关重要。本文阐述了外泌体中的物质变化对卵母细胞发育状态的影响以及外泌体在不同生殖系统疾病如PCOSs卵巢癌及子宫内膜异位症中的变化。本综述中主要讨论外泌体中的miRNA现如今对于InCRNA和CirCRNA及相关蛋白质的研究较少，希望未来能进一步研究外泌体中蛋白质、InCRNA及CircRNA在生殖内分泌系统疾病中的作用机制。参考文献1NuttinckF.Oocyterelatedfactorsimpactingonembryoquality:relevanceforinvitroembryoproduction.AnimReprod,2018,15(3):271-277.DOI:10.21451/1984-3143-AR2018-0077.2PictonHM.PreservationoffemalefertilityinhumansandanimalspeciesJ.AnimReprod,2018,15(3):301-309.DOI:10.21451/1984-3143-AR2018-0089.3KumariyaS,UbbaYJhaRK,etal.Autophagyinovaryandpolycysticovarysyndrome:role,disputeandfutureperspective.Autophagy,2021,17(10):2706-2733.DOI:10.1080/15548627.2021.1938914.4NavakanitworakulR,HungWT,GunewardenaS,etal.CharacterizationandsmallRNAcontentofextracellularvesiclesinfollicularfluidofdevelopingbovineantralfolliclesJ.SciRep,2016,6:25486.DOI:10.1038srep25486.5SohelMM,HoelkerMfNoferestiSS,etal.Exosomalandnon-exosomaltransportofextra-cellularmicroRNAsinfollicularfluid:implicationsforbovineoocytedevelopmentalcompetenceJ.PLoSOne,2013,8(11):e78505.DOI:10.1371journal.pone.0078505.6胡§H,胡蓉，倪亚莉，等.卵泡微环境中外泌体对体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响J中华生殖与避孕杂志,2020f40(2):115-123.DOI:103760cma.j.issn.2096-2916.2020.0044.HuT,HuR,NiYL1etal.Effectoffollicularmicroenvironmentonpregnancyoutcomeofinvitrofertilizationandembryotra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